小麦与条锈菌亲和互作的差减文库构建及初步分析

 【目的】构建小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离条锈菌侵染小麦过程中的差异表达基因。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌相应毒性小种CY31号为材料,构建条锈菌侵染阶段的SSH-cDNA文库,挑选250个阳性克隆测序并进行生物信息学分析。【结果】聚类后得到149条非冗余EST（unigene）。经Blast X比对和功能分类分析,其中50条unigene（33.6%）未找到同源性匹配,25条（16.8%）与未知功能蛋白同源性较高;其余74条功能已知的unigene中,与初级代谢、能量相关的基因分别有13条和10个,占8.7%和6.7%,感病及防御相关的基因有6个约占4.0%;此外,获得两个与病原菌有较高同源性的基因。随后,进一步利用RT-PCR对6个基因的表达模式进行了分析。【结论】成功构建了小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离出一部分与小麦条锈病发病相关的基因,可用于进一步研究条锈菌侵染过程中特异基因的功能。     

鄂西地区稻瘟病菌生理小种文库的构建及初步鉴定

[目的]构建鄂西地区的稻瘟病菌文库,并对其进行初步的鉴定分析。[方法]从鄂西地区7个水稻主产区不同的水稻品种上收集稻瘟病感病稻秆,进行分离、纯化和菌落形态的初步鉴定分析,并利用RAPD和REMAP分子标记对该文库进行聚类分析。[结果]建立了含有52种菌株的稻瘟病菌生理小种文库;聚类分析结果表明,鄂西地区的稻瘟病菌群体结构呈现多样性和复杂性,遗传谱系与菌落形态之间并不存在简单的一一对应关系。[结论]该研究为预测鄂西地区病原菌群体的变化趋势以及水稻抗病品种的选育,奠定了基础。     

水稻L-半乳糖脱氢酶基因的克隆与序列分析

[目的]对水稻L-半乳糖脱氢酶（L-GalDH）基因进行克隆与序列分析。[方法]通过RT-PCR从水稻中克隆了L-GalDH基因,采用GenBank的BLAST程序进行序列分析。[结果]水稻L-GalDH基因的cDNA全长1 340 bp,包含一个长为951 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与其他植物的L-半乳糖脱氢酶基因的同源性较高,其中与大麦的同源性最高,序列一致率为92%,与菠菜的序列同源性稍低,一致率为71%。系统进化分析结果表明不同来源的L-GalDH基因聚为3类。[结论]该研究为L-GalDH基因的功能研究打下了基础。     

玉米γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]对玉米γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）基因进行克隆和分析研究。[方法]通过RT-PCR扩增得到玉米γ-TMT基因的cDNA序列,同时对序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统进化分析。[结果]玉米γ-TMT基因cDNA全长1 310 bp,包含一个长为1 059bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与小麦和水稻等高等植物的γ-TMT基因同源性较高,序列一致率为69%～87%;与低等生物褐藻的序列同源性较低,一致率只有56%。系统进化分析表明不同来源的γ-TMT基因可聚为3类。[结论]为进一步研究γ-TMT基因的功能奠定了基础。     

短短小芽孢杆菌TW-2菌株对水稻穗颈瘟的防治效果

[目的]探讨生物农药的防治原理,寻找防治稻瘟病的新方法。[方法]采用系列稀释平板法测定生防菌TW-2对水稻稻瘟病菌的菌丝生长的抑菌活力,计算生防菌的抑菌活力回归方程式、EC50值和相对毒力。[结果]生防菌TW-2对田间水稻穗期的穗颈瘟的防效在80%以上。[结论]生防菌TW-2对水稻稻瘟病菌具有强烈的抑制作用,对水稻稻瘟病具有较高的防治效果。     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT—PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析（摘要）

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。     

大珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

[目的]探讨重金属对大珠母贝苗种存活的影响。[方法]对大珠母贝金属硫蛋白基因进行克隆和序列分析。[结果]结果表明,通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599 bp,5′UTR（Un-translated region）为75 bp,3′UTR为296 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）为228 bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。[结论]该研究为海洋贝类金属硫蛋白的进化及功能研究提供基础资料。     

甜菜夜蛾核多角体病毒Se29基因的克隆与序列分析

[目的]克隆得到甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exiguamulticapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）ORF29全长基因（Se29）。[方法]用PCR的方法扩增Se29基因,将其克隆至pMD18-T载体上,获得了重组质粒T-Se29,进行序列测定和分析。[结果]获得大小为642 bp左右的序列,扩增序列与GenBank登录序列（Genbank accession No.NC002169）核苷酸同源性100%。序列分析结果表明,Se29基因编码蛋白（SE29）存在一个可能的跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,1个微体C末端靶信号位点。蛋白序列比对结果表明,SE29与棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovir-us,HaSNPV）ORF128（Ha128）的编码蛋白（HA128）具有较高的同源性,其在病毒侵染过程中的作用值得关注。[结论]成功克隆出Se29基因,为研究其在病毒侵染过程中的作用奠定了试验基础。     

Expression of special genes inhibited by powdery mildew (<Emphasis Type="Italic">Blumeria graminis</Emphasis> f. sp. <Emphasis Type="Italic">tritici</Emphasis>) in wheat germplasm N9436

Powdery mildew, caused by Blumeria graminis f. sp. tritici, is one of the most important fungal diseases in common wheat (Triticum aestivum L.) worldwide. Wheat germplasm N9436 is resistant to powdery mildew. In the present study, a backward subtracted cDNA library was constructed with cDNA from N9436 leaves inoculated by Blumeria graminis as the driver and cDNA from uninoculated N9436 leaves as the tester. A total of 120 positive clones were randomly chosen from the SSH-cDNA library and were amplified with sp6 and t7 primers to examine the insert size. After screening the repeated and redundant sequences, 59 expressed sequence tags (EST) were acquired. Nucleic acid and protein homology search were performed using the basic local alignment search tool (BLAST) program with the default settings at NCBI website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). BlastX results in nr-protein database revealed that 23 ESTs were highly homologous with known proteins involved in primary metabolism, energy metabolism, transport, signal transduction, and disease resistance and defenses. BlastNr results showed that 47 and 10 ESTs had high identities with known Unigene and function-unknown ESTs, respectively, and two ESTs matched none in the nr-database. Twenty-one ESTs were both in the nucleic acid and protein databases, including seven ESTs associated with powdery mildew resistance. Among them, one was responsible for signal transduction and six for systemic acquired resistance (SAR) system.     

细菌性条斑病菌JH01诱导水稻抗病均一化差减文库的构建

[目的]构建细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减c DNA文库,对获得的差异表达ESTs进行生物信息学及抗病相关基因的表达分析。[方法]以水稻IR26(Tester)和两优培九(Driver)幼苗5~6叶期叶片为材料,采用双链特异性核酸酶(DSN)介导的均一化消减杂交技术,构建细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻抗病相关基因差减c DNA文库,以p LB-F和p LB-R为引物,通过菌液PCR扩增对差减文库的质量进行检测。[结果]c DNA文库的插入片段分布在0.5~2.0 kb,平均大小约为1.0 kb,重组率达95%。序列测定分析发现,随机挑取的504个克隆中有98条差异表达基因;经BLAST比对和GO注释发现,59条序列具有同源基因,分别参与信号转导、能量代谢、过敏性坏死反应、防卫反应等;另外39条序列无相似基因,有待进一步研究。通过实时荧光定量PCR发现,从该文库中分离得到的Os NDPK4参与细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。[结论]水稻受细菌性条斑病菌侵染的c DNA文库质量较好,为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定基础。     

水稻EST中微卫星分析

[目的]分析水稻EST中微卫星序列。[方法]利用MISA(MIcroSAtellite)软件分析了微卫星在水稻EST中的分布频率与密度。[结果]在1 690 257条EST序列中,有907 071条序列含有微卫星,微卫星之间的距离约为0.51 kb。其中,六碱基重复丰度最大,占47.1%,而三碱基、单碱基、四碱基、二碱基和五碱基重复丰度分别为22.4%、18.5%、6.8%、3.1%和2.1%。表明三碱基重复丰度占到较高比例(22.4%),因此可从现有的ESTs数据中方便地获取有效的水稻微卫星标记。[结论]该研究结果可以为水稻种质资源鉴定和品种改良提供有用的基因信息资源。     

紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因全长cDNA的电子克隆及同源建模

[目的]研究对紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因全长cDNA进行电子克隆及同源建模的方法。[方法]根据物种间同源基因相对保守的特点,利用NCBI数据库,对公共EST数据库进行同源检索筛选和重叠群装配,获得拼接cDNA序列,经过ORFFinder分析后获得相应蛋白质的全长序列,并利用Swiss-Mode服务器预测各原子坐标,进而利用Swiss-PdbViewer生成三维空间模型。[结果]采用该方法成功获得紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因的完整cDNA序列,全长为1880bp,mPPI蛋白质编码68AA,分子量约为7829.9Da,理论等电点pI=8.99,原子组成为C338H547N103O103S4,摩尔消光系数280nm处为4595,不稳定系数为42.16,脂肪系数为83.24,总平均亲水性为-0.456。[结论]根据物种间同源基因序列对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选和拼接,是基因克隆的一条有效途径。     

UV-B辐射胁迫下桃蚜差异基因表达的分子生态初步研究

【目的】研究紫外线UV-B对蚜虫种下分化的影响,筛选、鉴别UV-B诱导条件下差异表达的基因,阐明蚜虫对UV的耐受和反应机理以及分子变异机制,为蚜虫UV-B胁迫条件下的分子生态遗传与进化研究提供理论依据。【方法】以UV-B胁迫桃蚜种群cDNA为试验方(Tester),以正常条件下桃蚜种群cDNA为驱动方(Driver),应用抑制差减杂交(SSH)技术,研究了UV-B胁迫下桃蚜特异基因的表达,并随机选取100个EST克隆测序,分析差异基因的功能。【结果】蚜虫体内参与紫外胁迫的相关基因有6类,其中胁迫诱导相关基因占总基因的10.64%,核酸、脂肪酸代谢相关基因占14.89%,转录相关基因占9.57%,结构蛋白和蛋白合成相关基因占9.57%,共生菌相关基因占8.51%,未知功能基因占19.15%,未知基因占27.66%。半定量RT-PCR扩增结果显示,热休克蛋白70、辅酶NADH、氧化还原酶、表皮蛋白在处理和对照之间的差异均达极显著水平(P0.01),而看家基因在对照和处理间无显著差异。【结论】蚜虫种群对紫外线胁迫的反应不仅依赖于抗氧化作用,还是一个多种抗性途径和多基因协同作用的复杂体系。     

梅EST-SSR特征及其对红叶李的可转移性研究

【目的】分析梅EST-SSR特征及其对红叶李的可转移性。【方法】从National Center for Biotechnology Information(NCBI)下载4 589条梅表达序列标签(Expressed Sequence Tag;EST),去除无效碱基后进行拼接和简单重复序列(Simple Sequence Repeat)位点查找;设计引物进行PCR扩增。【结果】获得4 392条unigene,长度为2 420.422kb;搜索到776个SSR位点,分布在650条EST上,出现频率为14.8%。随机设计了15对引物,以4个红叶李品种基因组DNA为模板,进行了PCR扩增,有9对引物可以扩增到清晰稳定的产物,6对多态性引物共检测出20个位点,平均每对引物可以扩增出3.3条多态性片段,平均多态性信息含量(PIC)为0.8。【结论】SSR位点在梅EST序列上分布频率较高,梅EST-SSR在红叶李中具有较高的多态性,可用于红叶李亲缘关系分析和遗传图谱构建等方面的研究。     

毛竹萌发种子全长cDNA文库的构建

[目的]构建毛竹萌发种子的全长cDNA文库。[方法]以毛竹萌发种子为材料,利用Oligo-capping法构建其全长cDNA文库。[结果]试验得到文库的库容达650万克隆,空载较少;插入片段大小在0.3～5.0 kb之间,片段大小的分级严格且一致性良好,其中显著的是长片段全长cDNA(1.0～5.0 kb)的比例高达30%,达到了高质量全长cDNA文库的标准。[结论]毛竹萌发种子全长cDNA文库的成功构建将为竹类植物功能基因组研究奠定重要的前期科研基础。     

蜜蜂TPI基因克隆与生物信息学预测(英文)

[目的]克隆蜜蜂(Apis mellifera)TPI基因,并进行生物信息学预测。[方法]利用电子克隆方法获得蜜蜂磷酸甘油醛异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)基因,并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白的等电点、疏水性/亲水性、二级结构等进行了预测。[结果]蜜蜂TPI基因全长为1768bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),所编码蛋白的等电点为8.515。二级结构预测表明TPI蛋白属于α/β蛋白。[结论]利用蜜蜂表达序列标签数据库(EST)电子克隆蜜蜂新基因的研究工作有一定的现实意义,为进一步在分子水平研究蜜蜂提供更多的参考。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。