含PHYA基因的EDSV转移载体构建及表达研究

将原核表达载体pET30中的黑曲霉源植酸酶基因(phyA)亚克隆到真核表达载体pCDNA 3的kpaI-EcoRI位点。根据pCDNA 3的序列在增强子的上游(209位)和BGH polyA下游(2049位)设计1对引物HM 1,HM2扩增出含phyA基因的表达盒。将此表达盒以平末端连接的方式克隆到减蛋综合征病毒(EDSV)基因组右末端的转移载体pUHBC的Sall位点,酶切分析鉴定表达盒的方向,得到反向插入重组质粒pEDS-phyA。用Lipofectamine 2000将8μg pEDS-phyA转染90％满度的鸭胚成纤维细胞,6h后换生长液,24h后收获细胞,以puHBC转染作对照。钼酸胺法测定试验样品植酸酶酶活为977U／mL。实验结果表达我们已成功地构建了含植酸酶基因的转移载体,为进一步构建重组减蛋综合征病毒载体表达植酸酶打下基础。     

减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的克隆与真核表达载体的构建

应用降落PCR技术扩增出减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因并将其克隆至pMDT-18载体上,酶切、PCR及测序结果表明插入的片段为目的基因.切下该目的基因定向克隆至pcDNA 3质粒构建六邻体蛋白基因真核表达载体pcDNA 3-hexon,经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序鉴定,证明六邻体蛋白基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误,从而为下一步的转染、表达及进一步阐明EDSV六邻体基因结构与功能的关系和减蛋综合征基因工程苗的研究奠定了良好的基础.     

含CpG序列PRRSV SD2 E基因真核表达载体质粒构建及表达

为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。     

伪狂犬病毒基因转移载体的快速构建及其瞬时表达

以含有伪狂犬病毒（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｕｓ,ＰＲＶ）蛋白激酶（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ,ＰＫ）基因的重组质粒为基础,利用非互补粘性经过部分补平后成为粘性末端,再进行连接的方法克隆了与载体分子大小相当的报告基因表达盒。用限制发现人切酶分析确证了伪狂现毒表达载体中报宽大圊窝囊斩主方向,并通过导入细胞后检测外源基因在体外的瞬时表达,直接鉴定一表达载体的生物学活性。     

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.     

一种非EDSV引起的鸭传染性减蛋症

自1999年5月以来，浙江省许多产蛋鸭发生了一种以产蛋率锐减为特征的新疾病，其中某地区67户养鸭专业户，共饲养蛋鸭15.7万羽，陆续进入产蛋高峰期后，有2375 羽鸭群的产蛋率突然下降，由原来的91.2%减到52.7%，同时伴有畸形蛋、沙壳蛋，蛋质低劣，蛋清稀薄，除少部分病鸭伴有烦躁不安和吵棚外，鸭群的精神体态基本正常，采食量略有下降，一般不引起死亡。起初养鸭户都误认为是当地饲料厂供应的饲料所致，后来发现该病具有传染性，疫病主要沿河流自上而下蔓延。在此后1个多月时间内，共有49户养鸭户12.3 万羽蛋鸭相继发病，产蛋率下降幅度为20%～80%，使用各种抗菌药物治疗无效，提高饲料营养也不起作用。该病发病急，传播迅速，通常在2～3天内产蛋率由80%～90%以上下降到30% ～40%，有的甚至更低，产蛋率越高，感染后下降幅度往往越大。病鸭从产蛋下降到康复需3 -7周时间，恢复后不能达到标准产蛋曲线，产蛋周期缩短。剖检病鸭主要表现为生殖器官病变，卵巢卵泡减少、萎缩，输卵管蛋白分泌部缩小，蛋白分泌腺减少，子宫萎缩，有的严重病例可见卵黄性腹膜炎，肝、心、肾和肺有斑点出血。该病的临床症状类似于减蛋综合征（ EDS）［1］，但是，用减蛋综合征灭活苗免疫预防不能有效保护。作者对病鸭体作无菌检查并分离了病毒（命名为YH99株），用0.2 μm滤器过滤后，经人工感染易感蛋鸭能成功诱导典型发病，再从病鸭中回收到同样病毒。将YH99株与鸡源减蛋综合征病毒（EDSV-AV127）［2～4］和鸭源减蛋综合征病毒［3］（EDSV-JE 1，由上海市畜牧兽医站周锦萍提供）进行比较，结果发现：     

EDSV HN03株纤维蛋白基因的克隆与序列分析

【目的】研究减蛋综合征病毒(EDSV)河南HN03株纤维蛋白基因全序列,为进一步分析EDSV纤维蛋白基因的结构、功能以及EDSV基因工程疫苗的研究奠定基础。【方法】根据GenBank中收录的EDSV纤维蛋白基因序列(Z86065),设计并合成了1对引物,PCR扩增EDSV河南HN03株纤维蛋白基因。将扩增产物克隆入pTG19-T载体并测序。【结果】测序结果表明,HN03株纤维蛋白基因为1935 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码644个氨基酸,推导的氨基酸序列有5个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,EDSV HN03株与EDSV国际标准株AV-127纤维蛋白基因核苷酸同源性为99.3%,氨基酸同源性为99.2%;与鹌鹑腺病毒QU株纤维蛋白基因核苷酸同源性为98.9%,氨基酸同源性为98.4%。【结论】腺病毒纤维蛋白基因相当保守。     

猪流感病毒NP基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/ Swine/ Inner Mongolia/ 547/ 01 (H3N2)的NP基因,并将其克隆入pMD 18-T载体.重组pMD 18-T经Sal I 和 EcoR I酶切后得到的NP基因插入pMelBacB载体的Sal I/EcoRI位点.PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacB-NP转移载体.这为开发NP诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础.     

猫爪草酰基-Δ9脱氢酶基因植物表达载体的构建及瞬时表达

猫爪草种子能高水平积累棕榈油酸(C16∶1Δ9)和顺式-11-十八碳烯酸(C18∶1Δ11)等具有食品、医药和工业应用价值的ω-7脂肪酸(ω-7 FA)。酰基-Δ9脱氢酶(acyl-Δ9 desaturase,Δ9D)底物特异性决定着植物细胞合成单烯脂肪酸的种类。为检测来自猫爪草的酰基-ACP-Δ9脱氢酶(MucACP-Δ9D)是否可异源表达用于在其他植物合成ω-7 FA,文章构建了MucACP-Δ9D基因植物表达载体,并通过农杆菌介导在本氏烟草叶组织瞬时表达。用气相色谱(GC)检测烟叶脂肪酸成分,结果显示,野生型及空载体对照的ω-7FA总含量仅为0.4%;然而,MucACP-Δ9D瞬时表达的烟叶组织ω-7 FA总含量提高到14.2%,其中,C16∶1Δ9和C18∶1Δ11含量分别达8.8%和5.4%。研究表明,MucACP-Δ9D可在异源组织催化棕榈油酸合成,可进一步用于其他油料作物的油脂遗传改良,以富集ω-7 FA。     

耐盐基因HAL1的克隆及植物表达载体的构建

对编码调节离子转运蛋白的基因HAL1进行克隆、序列测定,并对植物表达载体进行构建。基因测序分析表明：该基因含有885个核苷酸,与GenBank上公布的HAL1基因的核苷酸同源性为99.30%,氨基酸序列同源性为99.32%。利用HindⅢ和XbaⅠ切点插入质粒pBY505的Actin启动子与PIN终止子之间,构建成适宜于直接转化法转化植物的表达载体pBHAL1。     

金黄色葡萄球菌fbB基因D2-D3编码区克隆及其植物表达载体构建

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌,其表面的纤连素结合蛋白(FnBP)在介导金黄色葡萄球菌侵入寄主细胞的过程中发挥着重要作用.因此,FnBP成为奶牛乳腺炎亚单位疫苗研究中的重要靶标.本研究根据Genbank中纤连素结合蛋白B基因(fnbB)D区编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增D2-D3区,将该片段回收后与pCAMBIA3301植物表达载体同时进行Nco Ⅰ和Eco 065 Ⅰ(BstEⅡ)双酶切,酶切片段回收后进行连接,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,通过菌落PCR、酶切鉴定等方法筛选阳性克隆,将阳性克隆送公司测序确定DNA序列.结果表明,阅读框架正确,氨基酸序列无突变,成功构建金黄色葡萄球菌fnbB基因D2-D3区植物表达载体.该研究为研制奶牛乳腺炎转基因植物口服疫苗奠定了基础.     

拟南芥Ca~(2+)泵基因ACA_2的RNAi载体的构建及转基因植株的筛选

构建了含拟南芥Ca2+泵基因ACA2特异片段反向重复结构的RNA i载体,通过根癌农杆菌介导转化拟南芥,用卡那霉素筛选和PCR检测,获得了12个T3代纯合体转基因株系;半定量RT-PCR方法检测ACA2在转基因株系中转录的结果表明,其转录产物比野生型(WT)明显降低,且转基因株系之间差异明显,表达水平有1个梯度关系,因此,我们初步确定沉默Ca2+泵基因ACA2的RNA i载体是起作用的。     

FR 02全长基因的克隆表达载体的构建及转化苹果

从铁胁迫诱导的拟南芥植株根中克隆了全长的FR 02(Fe3+-螯合物还原酶)基因,并将FR 02基因构建到了植物高效表达载体pCB 302中.通过农杆菌介导的转化和PCR及Southern blot检测证明FR 02基因正向的插入了苹果基因组中.以破坏生长点的茎尖为外植体的苹果基因转化方法转化率高达10.8%.FR 02全长基因的成功克隆、构建和转化为高铁、抗黄化苹果和其他高铁作物新品种的培育开辟了一条新路.     

FR 02全长基因的克隆表达载体的构建及转化苹果

从铁胁迫诱导的拟南芥植株根中克隆了全长的FR02（Fe^3＋-螯合物还原酶）基因,并将FR02基因构建到了植物高效表达载体pCB302中。通过农杆菌介导的转化和PCR及Southern blot检测证明FR02基因正向的插入了苹果基因组中。以破坏生长点的茎尖为外植体的苹果基因转化方法转化率高达10．8％。FR02全长基因的成功克隆、构建和转化为高铁、抗黄化苹果和其他高铁作物新品种的培育开辟了一条新路。     

动物乳腺特异表达载体的构建及其表达特性研究

为了研制动物乳腺生物反应器,用中国奶山羊β-乳球蛋白基因的5′、3′-侧翼区和β-酪蛋白基因的第1内含子构建动物乳腺特异表达载体p205C3.细胞表达试验结果显示,p205C3载体能够指导lacZ基因在SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞中表达,不能指导该基因在COS-1细胞和山羊成纤维细胞中表达.将人激肽释放酶(hKLK1) cDNA克隆入p205C3载体,用获得的重组载体p205C3KLK1注射哺乳期小鼠,然后取其心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、胰腺和乳汁,酶活性测定结果显示,乳汁中的酶活性高达255.65 U·mL-1,其他组织中的酶活性与正常小鼠无差异.结果表明p205C3载体不仅能有效地指导外源基因在山羊乳腺细胞和小鼠乳腺中表达,而且表达具有较好的组织特异性,可以用于动物乳腺生物反应器的研制.     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre/loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre.将位于质粒pTIABn中的雄性不育基因表达盒(含TA 29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp 2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位点切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn.PCR方法从溶原菌BM 25.8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35 S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre.     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre／loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pTTABn中的雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位．占、切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn。PCR方法从溶原菌BM25．8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。     

NOS/HuIFNa嵌合基因的构建及其与Ti质粒载体的拼接

将人α干扰素(HuIFNa)基因的全长cDNA克隆到nos启动子的下游,并在3＇端加上nos的3＇末端片段,得到人α干扰素基因插入方向同nos启动子一致的重组质粒pLQP24和方向相反的重组质粒pLQN2,并分别同Ti栽体pARCl2拼接。将NOS/HuIFNa引入到pARCl2的T区端臂内,构建成重组质粒pLPP3和pLNP20通过接合转移将这两个重组质粒引入到根癌土壤杆菌LBA4404。