镉胁迫对黄鳝醛酮还原酶基因表达的影响

采用RACE-PCR技术获取黄鳝醛酮还原酶(Eakr)基因5′cDNA末端和3′cDNA末端,采用基因特异性引物扩增其内含子序列,获得其基因结构;将黄鳝养殖在15 mg/L CdCl₂的曝气水中,分析Cd²⁺处理对Eakr基因表达的影响;采用液体培养和斑点展示法,比较重组Eakr基因菌株和阴性对照菌株在Cd²⁺暴露下的存活率及生长活力。研究结果表明,Eakr基因全长4468 bp,包含1026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸,5′端非编码区74 bp, 3′端非编码区195 bp。荧光定量PCR检测发现,Eakr基因在黄鳝的脑、血细胞、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肌肉、性腺、皮肤、脾脏、胃中均有表达,在肝脏中表达水平最高(P<0.05)。Cd²⁺胁迫下,肝脏中Eakr基因与Nrf2基因mRNA表达水平均显著上升;在各检测时间点,Eakr基因表达水平相比对照组均差异极显著(P<0.001),而Nrf2基因表达水平在处理后6、9、12 h差异极显著(P<0.001);含Eakr基因的...     

黄鳝转铁蛋白基因的克隆及其N-lobe的重组表达

以黄鳝（Monopterus albus）肝脏c DNA为模板,利用RACE-PCR扩增了黄鳝转铁蛋白Tf基因5’和3’c DNA末端,构建了Tf基因N端原核表达载体;转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后经过Ni-NTA His·Bind Resin亲和柱分离纯化获得Tf-N蛋白;利用琼脂糖扩散抑菌圈法验证Tf-N蛋白的抑菌作用;分析了Tf-N蛋白对黄鳝肠道假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）铁获取作用的影响。结果显示：成功克隆了黄鳝Tf基因全长,构建了pET28a/Tf-N重组表达载体,获得了纯化的Tf-N蛋白;Tf-N蛋白可抑制假单胞杆菌的生长,能与假单胞菌来源的Bfr蛋白一起共同促进假单胞杆菌的生长。该研究结果可为进一步探索鱼类Tf基因的功能提供参考。     

鲮生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

IPTG诱导含有鲮（Cirrhinus molitorella）生长激素基因（growth hormone,GH）的工程菌M15（pQE30-GH）重组表达鲮生长激素蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳结果表明,在24.5kDa处有1条重组表达鲮生长激素条带,经分离纯化、复性和浓缩后得到有活性的重组鲮生长激素蛋白。以复性浓缩后的重组鲮生长激素蛋白为抗原,采用改进的方法对新西兰大白兔进行皮下多点免疫注射,获得兔抗鲮生长激素多克隆抗体。经ELISA检测该免疫血清的滴度为12800。以该多抗为一抗,Western blotting可以检测到10ng的抗原量;并且在鲮垂体组织提取液中和血清中检测到一种能与该血清作用的大小约为21.5kDa的蛋白条带。说明该试验所制备的兔抗鲮生长激素多克隆抗体具有较好的免疫活性。     

黄鳝血清转铁蛋白多克隆抗体的制备及检测

为实现黄鳝血清转铁蛋白基因的原核表达并制备其多克隆抗体,利用基因特异性引物从黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝转铁蛋白的C端序列,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET/Tf-C重组表达载体;转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和层析技术纯化Tf-C蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA技术和组织蛋白印迹对制备的多克隆抗体进行检测。试验结果表明,成功构建pET/Tf-C原核表达载体,并实现了蛋白的表达和纯化;制备的多克隆抗体效价大于1∶25 600,并能特异性地识别来源于黄鳝不同组织的血清转铁蛋白。研究结果对黄鳝血清转铁蛋白功能的研究奠定了基础。     

黄鳝脑芳香化酶基因cDNA的克隆及组织表达特异性分析

根据NCBI数据库报道的黄鳝芳香化酶基因的gDNA序列,设计了一对特异性引物.用Trizol试剂盒提取黄鳝脑总RNA,反转录获得cDNA第一条链,进行PCR扩增.扩增产物经过回收、连接、测序后得到了一条长1514 bp的芳香化酶基因cDNA序列.同源性比较表明该基因属于脑型P450aromB,与其他鱼类脑型P450aromB的同源性较高(>70%),与性腺型P450aromA的同源性较低(<60%),与自身性腺型芳香化酶同源性为59.5%.采用RT-PCR的方法对该基因在雄性黄鳝的各组织表达情况进行了分析,结果表明,该基因的转录本较高的表达于脑和精巢中,较低的在皮肤中表达,而在肝脏、心脏、小肠、肌肉等组织中没有检测到该基因的表达.     

黄鳝PLA2基因的克隆及表达分析

利用同源克隆技术和RACE技术克隆黄鳝(Monopterus albus)磷脂酶A2(PLA2)基因的cDNA全长;并采用荧光定量RT-PCR法检测PLA2基因在黄鳝各组织中的表达量情况。结果显示:黄鳝PLA2基因全长cDNA大小为2 606 bp(Gen Bank登录号:KX852397),其中开放阅读框2 205 bp,编码736个氨基酸,预测分子大小为83.623 kD,理论等电点5.84;5'和3'非编码区长度分别为208 bp和193 bp。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构。氨基酸序列比对和系统树分析显示,黄鳝PLA2基因的结构十分保守,黄鳝与大黄鱼和金头鲷的PLA2基因亲缘关系最近,与鼠类和蟾蜍的亲缘关系较远。RT-PCR分析表明,PLA2基因在组织中的表达具有组织特异性,在消化器官前肠组织中的表达最高,在性腺及肌肉组织中表达很少。     

中华鳖StAR基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

为探索StAR基因在中华鳖性腺发育过程中的作用,利用RACE技术克隆获得中华鳖StAR基因全长cDNA,qRT-PCR分析其在不同组织及胚胎不同发育时期的表达情况,并制备多克隆抗体,采用Western blot检测StAR在不同组织中的表达情况,通过免疫组化进行定位,同时检测来曲唑处理雄性中华鳖后StAR在精巢中的表达情况。结果显示,该基因全长2 377 bp,开放阅读框903 bp,编码300个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析表明,中华鳖StAR与龟类亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,StAR基因在精巢中表达量最高,显著高于其他组织;StAR基因于中华鳖胚胎发育16期已有表达,早于性腺分化启动时期;来曲唑处理的中华鳖精巢中,StAR表达量先上调后回降。本研究利用原核表达系统构建中华鳖StAR基因原核重组表达载体,经蛋白纯化后免疫小鼠,获得中华鳖StAR多克隆抗体。Western blot检测结果显示StAR在不同组织中的表达量与荧光定量结果一致。免疫组化结果显示,StAR蛋白在卵巢间质细胞、精巢间质细胞,精原细胞及胞质中表达。综上所述,StAR基因可能是中华鳖性腺分化关键...     

黄鳝载脂蛋白A1的基因结构及表达谱分析

根据克隆的黄鳝载脂蛋白A1基因的部分序列,进行5′RACE扩增和内含子的克隆并采用荧光定量PCR分析该基因的表达谱。结果表明,该基因cDNA全长1207bp,5′UTR区域长32bp,编码1个262aa的多肽;在长1391bp的gDNA上,只发现了1个长184bp的内含子。荧光定量PCR对该基因在不同组织和病原细菌嗜水气单胞菌感染后的表达情况分析表明,该基因转录本在肝脏中表达量最高,在胃、肾脏、小肠、脑、皮肤和血液中表达量中等,而在心脏、脾脏和肌肉中表达量很低;病原细菌感染会显著影响该基因在小肠、肝脏和脾脏中的表达水平。以上结果显示黄鳝的载脂蛋白Apo-A1基因可能参与了鱼体的天然免疫反应。     

仿刺参补体AjC3部分基因的原核表达及多克隆抗体的制备

通过制备仿刺参补体C3(AjC3)多克隆抗体,为进一步研究仿刺参补体AjC3免疫机制奠定基础。利用PCR技术扩增AjC3部分基因片段(4556~5110bp),将该片段与原核表达载体pGS-21a连接。将重组表达质粒转化到Transetta(DE3)中经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍柱纯化后,作为抗原免疫小鼠制备AjC3多克隆抗体。分别用间接ELISA,Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,PCR扩增得到约555bp的目的片段,重组蛋白分子量大小约56ku;间接ELISA检测抗体效价达1∶25600,Western blot结果显示,多克隆抗体具有良好的特异性。该试验成功的制备了补体AjC3多克隆抗体,为补体AjC3的进一步研究提供了检测工具。     

紫贻贝LC3B蛋白的原核表达及抗血清制备

LC3B是检测自噬程度的标志性分子,但是在低等动物体内缺少特异性强的LC3B抗体。为研究贝类的自噬性细胞死亡,本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆到pET-32a原核表达载体中构建重组表达载体,进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进行摸索;采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,并采用SDS-PAGE检测及Western blot进行验证;利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体。结果显示,在20℃,转速为150 r/min条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导表达10 h后,可以得到高表达量、可溶性的重组MgLC3B-His融合蛋白,亲和层析纯化后,获得单一条带的MgLC3B-His可溶性重组蛋白;采用纯化后的MgLC3B-His融合蛋白对新西兰兔进行多次免疫,采集分离兔抗血清并利用protein A纯化,获得紫贻贝的LC3B多克隆抗体,效价为25 600。紫贻贝LC3B多克隆抗体的成功制备,为今后深入开展紫贻贝及相近物种的细胞自噬研究奠定了基础。     

鲤春病毒血症病毒G蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR方法扩增鲤春病毒血症病毒糖蛋白G的部分基因序列,即全基因组序列上第3 094~4 170位的碱基,并将其克隆至表达载体pGEX-KG中,构建重组质粒SVCV-g-KG。将重组质粒转化感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,表达了与预期大小相符的约66 kDa的融合蛋白,可溶性分析表明该蛋白主要表达在包涵体中。将纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。酶联免疫吸附试验检测其抗体效价可达1∶256 000,间接免疫荧光试验和免疫印迹试验证明其与病毒结合活性良好,特异性高;病毒孵育试验结果表明该多克隆抗体具备中和活性,能够有效阻断鲤春病毒血症病毒对细胞的感染。     

黄鳝短期饲养催肥技术

介绍了体重在150 g左右的黄鳝的短期饲养催肥技术,包括池塘准备、苗种放养、饲养管理及病害防治等.经3个月的催肥饲养,体重150 g左右的黄鳝达到上市规格.     

池塘网箱饲养黄鳝技术

黄鳝是肉食性鱼类 ,且喜吃活食。在自然条件下 ,以小鱼、小虾、河蚌、小蛙、昆虫及其幼体 ,以及大型浮游动物等为食 ,当动物性饲料不足时 ,也兼食一些植物性饲料 ,如水草、瓜菜类、谷物等。黄鳝大多栖息于稻田、池塘、沟渠和湖泊等水域的底层泥土中 ,也有在田埂、堤坝、塘埂中挖洞穴居的 ,有昼伏夜出的习性 ,多在傍晚和夜间活动和觅食。人工饲养时主要投喂蚯蚓、蚕蛹、蝇蛆、小鱼小虾及冰鲜低值鱼块等。经过适当驯化 ,也可摄食配合饲料。黄鳝是我国居民食用相当普遍的水产品 ,年消费量很大 ,但由于近年来水域污染和过度捕捞 ,其野生资源急剧…     

鳝池的建造和处理技术

根据作者多年的研究，提出了鳝池建造的五个基本要素，并从面积大小、池形、水口、鱼巢、食台和泥层等方面总结了黄鳝有土养殖池、无土养殖池和混合型养殖池的不同要求，还从脱碱、清池和水草投放等三方面概括了鳝池的处理技术。     

黄鳝胃和肠道的组织学研究

采用扫描电镜和光镜技术对黄鳝的胃和肠道进行了组织学研究。结果表明 ,作为一种肉食性鱼类 ,黄鳝的消化能力较南方大口鲶、长吻鱼危弱。根据黄鳝的胃肠道组织学特征探讨了它的消化特点 ,并指出了研制黄鳝专用配合饲料应该注意的几个问题     

虹鳟IL-17多克隆抗体的制备及初步鉴定

本研究根据NCBI已发表序列设计引物,提取经植物血凝素刺激后的虹鳟Oncorhynchus mykiss头肾细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增IL-17成熟肽基因,测序结果表明所获得的序列与发表序列相一致。将该基因重组至原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明:目的蛋白以包涵体形式表达,大小约为32k Da,重组蛋白经Ni-NTA系统纯化、复性后纯度达90%以上,以其免疫小鼠制备虹鳟IL-17多克隆抗体。ELISA结果显示其效价为1∶25 600,而间接免疫荧光结果显示所制备的多克隆抗体能够特异性地识别真核细胞中瞬时表达的虹鳟IL-17。本研究成功制备虹鳟IL-17多克隆抗体,为下一步IL-17在虹鳟黏膜免疫中的作用及其佐剂效应研究奠定基础。