木薯细菌性枯萎病菌转座子库的构建及其质量评价

为了研究木薯细菌性枯萎病菌的致病分子机理,本研究开展了病原菌的转化子库构建工作.采用电击法,将EZ::TN转座体转化野生型菌株.获得了总数为20 382个转化子并进行了质量评价,采用剪叶法从9 872个转化子中筛选出94个致病性变异的转化子.采用Tail-PCR获得了致病力丧失突变体Xtn62-36的侧翼序列,分析结果表明可能是外源片段插入预测基因AspCxam的编码区而造成致病力丧失.病原菌转化子库的构建及Tail-PCR技术的应用为进一步开展致病相关基因功能的研究提供了基础.     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

西瓜ClPDF2.1蛋白的原核表达及其对香蕉枯萎病菌的抑制活性测定

尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉引起的香蕉枯萎病严重危害中国香蕉产业。植物防卫素是一类小的富含半胱氨酸的抗真菌蛋白。本研究旨在了解西瓜（Citrullus lanatus）防卫素蛋白ClPDF2.1对香蕉枯萎病菌的抑制活性。提取西瓜RNA后反转录为cDNA,以西瓜cDNA为模板,克隆ClPDF2.1基因,将测序正确的ClPDF2.1连接到载体pGEX-6P-1,随后转化Trans BL21(DE3)pLysS,IPTG 诱导GST-ClPDF2.1融合蛋白表达16 h后,经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定GST-ClPDF2.1融合蛋白的表达,进行GST-ClPDF2.1融合蛋白体外抑制香蕉枯萎病菌生长的功能初探。本研究为进一步培育转基因香蕉抗病品种奠定基础。     

香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系的建立

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,建立香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp cubense race 1)遗传转化体系,并对影响转化效率的因子进行优化,明确了高效转化的条件为:农杆菌OD600为0.15,AS诱导浓度为150μmol/L,诱导时间为7 h,Focr1-N2孢子浓度为1×106个/mL,潮霉素B筛选的浓度为150μg/mL,诱导培养基pH值为5.5,共培养温度为25℃,共培养时间为48 h为最佳条件。构建了包含1 200个突变体的突变体库,并对1 200个突变体进行了致病性测定,初步筛选出致病性丧失突变体20个,致病性显著减弱突变体18个,致病性严重增强突变体53个。     

木薯细菌性枯萎病菌转座子库的构建及其质量评价

猫豆是广西种植的一种特色药用植物,近年来发生一些重要病害,为明确这些病害种类,对广西猫豆主产区进行主要病害种类调查和病原鉴定.每块地采取5点取样法进行取样调查,并通过形态特征和rDNAITS序列分析结果对病原菌进行鉴定.研究结果发现,猫豆上发生的主要病害有4种,分别为猫豆炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)、猫豆茎溃疡病(Phomopsis sp.)、猫豆斑枯病(Alternaria sp.)和猫豆褐斑病(Pseudocercospora sp.),这些病害的发病率达30％ ～80％.     

香蕉枯萎病菌的致病性测定及其RAPD分析

以分离自海南、广东的18个香蕉枯萎菌菌株为试验材料,进行致病性测定及RAPD分析.结果表明,分离自粉蕉的12个菌株为1号生理小种,而分离自巴西蕉的6个菌株为4号生理小种;1号生理小种菌株侵染粉蕉的发病率与4号生理小种菌株侵染粉蕉、巴西蕉的发病率都是100%;采自海南三亚市荔枝沟镇的15号菌株为强致病性的菌株,与其它5个4号小种菌株相比,差异显著;RAPD分析能区分1号4号生理小种,菌株的地理来源,致病力;引物OPM-15能用来鉴定1号和4号生理小种.     

一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基

为探寻在非无菌操作下能从土壤中快速且大量分离检测香蕉枯萎病菌,研制了一种用于检测香蕉枯萎病病原菌的选择性培养基-PCEA,其成分为:马铃薯200 g,CuSO_4·5H_2O 0.5 g,MgSO_4·7H_2O 0.6 g,KH_2PO_4 0.1 g,敌克松结晶粉(75%)3 g,硫酸链霉素0.75 g,95%酒精10mL,水1 000mL,pH5.8,琼脂18～20g.该培养基与其它常见分离培养基相比,无需无菌操作,且成分简单、检测率显著,抑菌效果好,病菌在其上生长快、菌落典型,是一种较为理想的选择性培养基.     

新型苯并咪唑类化合物对棉花枯萎病菌的毒力测定

采用菌落直径法,测定了12种新型苯并咪唑类化合物对棉花枯萎病菌的抑菌活性。结果表明:在测定浓度为200 μg/mL的情况下,12种新型苯并咪唑类化合物对棉花枯萎病菌的抑菌率达32.5%～89.45%。其中,化合物N-(3-甲基苄基)-1H-苯并咪唑、N-(3-氯苄基)-1H-苯并咪唑、N-(3-溴苄基)-1H-苯并咪唑对棉花枯萎病菌的抑菌率较高,分别为80.1%、89.45%、80.3%,它们对棉花枯萎病菌的EC50值分别为66.1 μg/mL、38.1 μg/mL、86.3 μg/mL,具有良好的抑菌活性;其他9种化合物抑菌活性均低于80%。     

农杆菌介导油菜黑胫病菌遗传转化

为优化建立农杆菌介导的油菜黑胫病菌遗传转化技术体系,以携带潮霉素磷酸转移酶基因的pCH-sGFP为载体,农杆菌LBA4404为介体,对油菜黑胫病菌的分生孢子进行转化.油菜黑胫病菌的最佳转化体系为:分生孢子浓度106个/mL,农杆菌OD600值0.6,乙酰丁香酮浓度200μmol/mL,pH 5.8,25℃,共培养4 d...     

香蕉枯萎病菌及其粗毒素对香蕉的致病性比较

从8种培养液中筛选出能诱导香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4)FOCAAA315菌株高产毒素的改良CzapekB培养液,FOCAAA315菌株在该培养液中培养第15d,镰刀菌酸(FA)产量高达669.2mg/L,蔗糖为诱导产毒的最佳碳源。采用伤根浸渍法接种,测定枯萎病菌和病菌发酵粗毒素对香蕉组培苗的致病性。结果表明,粗毒素接种可诱发与病原菌类似的病害症状。受侵染的植物组织在细胞水平上发生一系列形态结构和生理生化代谢的病理变化,包括细胞壁消解、侵填体堵塞气腔、粘胶质减少、淀粉量减少、细胞木质化和黄褐色胶状物堵塞导管等。香蕉枯萎病菌的粗毒素是重要的致病化学物质;利用病菌孢子悬浮液在香蕉苗期接种,可以作为室内快速鉴定香蕉品种抗病性的方法。     

海南大棚西瓜枯萎病病原菌生物学特性及室内毒力测定

对供试菌株海南大棚西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型进行了生物学特性的研究及杀菌剂室内毒力测定。生物学测定结果表明：菌丝在西瓜汁培养基上生长最好;菌丝生长和孢子萌发的最适温度分别为28和30℃;菌丝生长和孢子萌发最适pH值分别为7～8和7～9;光暗交替有利于菌丝生长;孢子致死温度为60℃、5 min;果糖和葡萄糖作为碳源利于菌丝生长;酵母浸粉和蛋白胨作为氮源利于菌丝生长。室内毒力测定结果表明：50%咪鲜胺锰盐WP对西瓜枯萎病菌的抑菌效果最好,其EC50为0.730 9 μg/mL;32.5%苯甲嘧菌酯SC、30%苯甲·丙环唑EC、10%苯醚甲环唑WG、25%溴菌·多菌灵WP和25%溴菌腈WP对海南大棚西瓜枯萎病菌也有较好的抑制效果,其EC50为1.884 7～8.161 0 μg/mL,该研究为田间防治海南大棚西瓜枯萎病提供了基础数据。     

香蕉枯萎菌原生质体形成与再生条件

通过对菌丝菌龄、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的种类和浓度等因素的实验研究,得到了一种制备香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)原生质体的有效方法,并在固体再生培养基上实现了原生质体的再生,再生率为22.5%。     

GFP标记的尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染西瓜过程观察

将绿色荧光蛋白基因转入西瓜尖孢镰刀菌FON中,并利用荧光共聚焦显微镜观察GFP标记菌株侵染西瓜的过程.结果显示,转化子连续转接4代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入菌株FON中;利用GFP标记菌株在荧光共聚焦显微镜下观察其侵染西瓜苗的过程,发现在1/2 MS培养的西瓜苗中,FON经过48 h侵染即可进入西瓜的根维管束,第3天便进入茎维管束,第4天进入叶维管束(包括叶柄和叶脉);在土壤盆栽条件下,侵染后2d FON进入西瓜的根维管束,第9天进入茎维管束,第11天进入叶维管束.培养基培养与土壤盆栽相比,培养基栽培FON侵染的速度更快.     

尖孢镰刀菌胡麻专化型(Fusarium oxysporum f . sp. lini) ISSR标记聚类分析

结合形态学特征和分子生物学方法对我国尖孢镰刀菌胡麻专化型菌株进行鉴定、聚类分析和遗传变异分析。结合传统分类方法和ITS序列分析,确定6省区96株菌株为尖孢镰刀菌。采用ISSR（简单重复序列区间）分子标记技术对这96株菌株进行分析,12条引物共扩增出800个条带,多态性条带数为797条,多态性为99.62%;在相似性系数为0.88处,96株供试菌株被分为5个类群。聚类结果表明,胡麻枯萎病菌种内存在明显的多态性,且ISSR类群与地理来源存在相关性。     

尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的生物学特性

通过对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株[Fusariumoxysporumf.sp.niveum(E.F.Smith)SnyderetHansen.]在不同培养基、不同温度、不同光照及不同的pH梯度条件下的生长速度、产孢情况等的对比,以及菌落、孢子形态特征观察,筛选出PDA、26℃、全日光照和pH7￣11为镰刀菌菌株生长和产孢最佳的培养基、温度和光照条件。并通过该菌株对几种杀菌剂的敏感性测验,发现丙环唑、烯唑醇、百菌清、代森锌4种生产常用杀菌剂对菌株的毒力具有显著差异,其中烯唑醇对该菌株的毒力最强。     

香蕉枯萎病菌粗毒素的毒性及其模型

以香蕉组织培养苗为受试植物,蕉苗受毒素作用后的病情指数为指标,测定香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)粗毒素对蕉苗的毒性。结果表明,毒素处理72,96,120和144h引致香蕉苗受害程度(以病情指数表示)达90的剂量(TD90)的质量浓度分别为2057.20,1245.49,549.54,380.19μgmL,蕉苗的受害程度存在着随处理时间延长和处理剂量的增加而加重的趋势。根据毒素对蕉苗的毒性测定结果,建立了蕉苗受毒素作用的“时间-剂量-受害程度”模型。根据模型的分析结果认为,粗毒素引致蕉苗受害的有效时间为96~120h,有效剂量质量浓度为260.0~130.0μgmL。      

2种激发子对西瓜枯萎病的诱抗作用

分别测定了来源于西瓜枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的细胞壁来源的水溶性、热稳定激发予对西瓜枯萎病的诱抗作用。结果表明：2种来源的激发子均有明显的诱导西瓜苗细胞壁木质化的作用，但来源于香蕉枯萎病菌的激发子对木质化的诱导活性比来源于西瓜枯萎病菌的要高；西瓜苗分别经2种激发子处理后，体内过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氮酶的活性均有异常的增加，但来源于西瓜枯萎病菌的激发子对这3种防御酶的诱导速度比来源于香蕉枯萎病菌的要快；经激发子诱导处理后瓜苗对枯萎病菌的抗性有了明显的提高，但来源于西瓜枯萎病菌的激发予的诱抗效果相对较好。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种致病性突变体△Focr4-1422生物学特性研究

为研究香蕉枯萎病菌4号生理小种致病性突变体相关致病基因的功能,研究了基因敲除子△Focr4-1422与野生型菌株193之间部分致病性相关的表型差异。结果表明,基因敲除子对巴西蕉的致病性减弱,荧光检测显示菌丝能够从根部扩散到根茎交界处的茎部。△Focr4-1422对细胞壁降解酶的抗性大大增强。基因敲除子△Focr4-1422和野生型193在相同的温度、pH值、光照条件和碳氮源培养基下的生长速率均没有达到极显著差异,两者的菌丝和孢子的致死温度也一致。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中。在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传。通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中。对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异。     

一株西瓜尖孢镰刀菌的致死温度和最适碳氮营养源

对采集分离的西瓜尖孢镰刀菌菌株的致死温度和最适碳氮营养源进行研究.结果表明,该病原菌分生孢子萌发的致死温度为60℃,菌丝生长的致死温度为80℃.测试的10种碳源和10种氮源中,对病原菌菌丝生长最适的碳源是葡萄糖,其次是麦芽糖和蔗糖,L-山梨糖最差;最适的氮源是DL-天门冬酰胺,其次是L-赖氨酸和甘氨酸,氯化铵、硫酸铵和L-胱氨酸最差.产孢量最适的碳源是L-山梨糖,氮源是k胱氨酸.