内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按103～107拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r2=0.998、r2=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%（107拷贝/反应除外）,说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

小鼠β-actin mRNA荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立定量检测小鼠β-actin mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为小鼠相关基因表达水平的分析提供方法。根据GenBank中登录的小鼠β-actin mRNA序列,针对保守区域设计并合成1对引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ技术的小鼠β-actin mRNA荧光定量PCR方法。结果表明,该方法扩增效率高(97.7%),定量线性范围广(9.3×10²~9.3×10⁷拷贝/反应),可重复性强,无非特异性扩增和引物二聚体,最小检出量为9.3拷贝/反应。试验结果为β-actin作为内参基因用于小鼠相关基因转录水平分析提供了基础。     

小鼠IL-6、iNOS TaqMan荧光定量PCR 检测方法的建立及应用

为探讨脑心肌炎病毒(EMCV)感染后IL-6、iNOS基因的表达水平,从分子水平深入研究EMCV的致病机制,分别针对小鼠IL-6、iNOS及管家基因β-actin 的基因序列设计特异性引物和探针,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-6、iNOS和β-actin的TaqMan real-time PCR检测方法。该方法线性关系好,IL-6、iNOS和β-actin标准曲线的相关系数均达到0.998;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×10¹拷贝/μL;特异性强,只有以总RNA反转录成的cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才检测到荧光信号;重复性好,组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感染小鼠的脑、心脏中IL-6、iNOS mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的TaqMan real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于小鼠IL-6、iNOS基因的检测及定量分析。     

实时荧光定量PCR构建朊病相关细胞因子标准品质粒和标准曲线

为能够用实时荧光定量PCR检测PrP106-126作用的鼠巨噬细胞细胞因子的表达水平,构建目的基因IL-1β、TNF-α、IL-6和内参基因β-actin的标准品质粒和标准曲线。根据GenBank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物;细胞经PrP106-126作用后,提取总RNA。经反转录、PCR扩增、纯化、连接和转化后,提取质粒并测序鉴定,获得IL-1β、TNFα-、IL-6和β-actin质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果显示,产物溶解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因和内参基因的标准品质粒和标准曲线。     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

检测鼠或鼠源细胞中坦布苏病毒荧光定量PCR方法的建立

利用DNAStar对GenBank上发布的坦布苏病毒(TMUV)的E基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性引物。按照相同的方法,设计另1对鼠源内参基因β-actin的引物。通过PCR扩增获得E和β-actin的部分片段,分别与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,分别用于实时荧光定量PCR中E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建。通过对反应条件进行优化,建立了以β-actin为内参基因的检测鼠或鼠源细胞中TMUV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对TMUV的最低检出量为10个拷贝,比普通PCR高1 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.45%;特异性试验的结果表明,该方法只能检测到TMUV的扩增曲线。对50份样品进行检测,该方法的检出率为100.00%(普通PCR为87.50%),并对组织中病毒载量进行了相对定量,进一步说明了该方法的敏感性高,可用于试验样品的检测,为研究该病毒对哺乳动物的致病特性提供特异性的检测方法。     

鸡Caspase-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。     

猪圆环病毒2型感染对小鼠脾脏中IFN-γ基因表达的影响

本研究对PCV-2感染对小鼠组织中IFN-γ基因表达的影响进行了分析。分别取各基因RT PCR扩增的回收产物进行序列稀释（10^-1~10^-6）,再进行实时荧光定量PCR扩增,扩增完毕后,进行熔解曲线分析,相对定量检测了PCV 2感染小鼠脾脏不同时段IFN γ基因的表达水平。试验结果表明,得到定量标准曲线,起始模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系,β-actin基因标准曲线为y=-3.32x+31.57,IFN-γ基因标准曲线为y=3.43x+45.83,PCV-2感染小鼠后脾脏IFN γ基因表达水平升高,但第14~28天 IFN-γ基因表达水平呈下降趋势。     

阿勒泰羊内参基因GAPDH和β-actin实时定量PCR重组质粒标准品的构建

为了研究阿勒泰羊的GAPDH和β-actin基因的实时定量方法,并为其相关功能基因的表达研究提供基础,试验采用荧光实时定量PCR法,克隆绵羊的GAPDH和β-actin部分基因序列,并以常规PCR产物为标准品,建立了标准曲线及熔解曲线。结果表明:标准曲线的相关系数分别为0.999 9和1.000 0,扩增效率分别为96%和109%;熔解曲线峰形锐利,无非特异性杂峰,表明PCR产物单一,无引物二聚体及非特异扩增产物。说明所建立的方法特异性强、相关系数高,可应用于阿勒泰羊的功能基因表达的定量分析研究。     

实时荧光定量PCR构建BIM基因表达标准品质粒和标准曲线

为了能够快速、准确定量BIM基因的mRNA,试验构建了小鼠BIM基因的标准品质粒和标准曲线,根据Gen Bank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物,从N2a细胞中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增该基因122 bp的核苷酸片段,经纯化、连接和转化后,提取质粒并进行酶切、测序鉴定,然后将阳性重组质粒10倍递减稀释作为标准模板,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,建立了BIM标准曲线及直线回归方程。结果表明:产物熔解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.998,线性关系好。说明成功构建了目的基因BIM的标准品质粒和标准曲线。     

鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank上鸡β-actin基因的序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green I染料建立了荧光定量PCR法（real-time PCR）。以常规PCR产物为标准品，建立了标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，标准曲线Ct值检测范围为12~31,扩增效率为95.1%；熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰，其Tm为88±0℃，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短，为β-actin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。     

锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据锦鲤疱疹病毒(KHV)胸苷激酶(TK)基因的保守序列设计一对引物和相应的TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,用于锦鲤疱疹病毒快速、灵敏、可定量的检测手段。构建并制备实时荧光定量PCR的标准品,对反应体系进行优化,并做特异性,敏感性和重复性试验。结果表明,成功构建荧光定量PCR标准品,建立荧光定量标准曲线,标准曲线的相关系数为0.992,所建立的荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,重复性好。     

基于等位基因特异性PCR原理建立鸡白痢沙门氏菌PCR方法

根据鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的rfbS基因在第237和598位碱基的不同,设计和合成等位基因特异性PCR引物,建立快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR方法,并应用该法对鸡白痢沙门氏菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能特异性地鉴定鸡白痢沙门氏菌,检测灵敏度达18 pg/μL DNA,4.7×10⁴ CFU/mL菌液,表明建立的等位基因特异性PCR方法能准确而快速地鉴定鸡白痢沙门氏菌。     

美洲狮和亚洲黑熊蛔虫ITS序列扩增及序列分析

以采自广州动物园美洲狮和亚洲黑熊体内的蛔虫样品为研究对象,提取样品的总DNA,以保守引物对核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增、测序及网上比对。结果表明,美洲狮体内样品获得与GenBankTM公布的狮弓首蛔虫相似性很高的ITS-1、ITS-2和5.8S序列,亚洲黑熊体内样品获得与GenBankTM公布的转移拜林蛔虫相似性很高的ITS-2序列,并首次获得样品的ITS-1与5.8S序列。序列分析结果表明,美洲狮体内蛔虫样品为狮弓首蛔虫,亚洲黑熊体内蛔虫样品为转移拜林蛔虫。     

番鸭IFN-α mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭IFN-α基因(GenBank登录号:JF894229)序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因(GenBank登录号:GU564232)为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法(RT-PCR)。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品(p-IFN-α和p-β-actin),分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99(r>0.99),扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为(93.6±0.26)℃和(85.3±0.15)℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。     

牛轮状病毒TaqMan实时荧光RT-PCR 快速检测方法的建立

本研究按照牛轮状病毒(BRV)结构蛋白VP6基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了BRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术。对BRV进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,TaqMan实时荧光RT-PCR最低可检测到100个拷贝病毒RNA;与牛病毒性腹泻病毒(BVD)、猪瘟病毒(CSFV)、牛结核杆菌(MB)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)不发生交叉反应;所制作的标准曲线在10²~10⁹拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.997;与常规的RT-PCR相比,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量BRV进行准确检测,对BRV的诊断有重要意义。     

金黄色葡萄球菌IsdD基因的克隆与表达

金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌,IsdD属于金黄色葡萄球菌Isd系统中的重要成员。本研究根据GenBank报道的金黄色葡萄球菌IsdD基因序列设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板扩增出目的片段IsdD,将其用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a(+)-IsdD。序列分析结果显示,目的基因序列与网上的IsdD序列相比核苷酸序列和氨基酸序列同源性均在98%以上。将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中并成功诱导表达出大小为61.3 ku的蛋白,这为下一步研究IsdD蛋白的结构和功能奠定了良好基础。     

体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板

本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,模板稀释度为2.95×104～2.95×108拷贝/L时,相关系数为0.998。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×104～2.95×108拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。