金柑属ISSR反应体系的建立及优化

以融安金弹(F.crassifolia Swingle)为试材,利用正交设计和单因素试验相结合的方法,对ISSR反应体系中各个主要影响因子进行了优化筛选,结果表明,20μL的ISSR反应体系中各组分的最适浓度分别为:Mg2+1.60 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,TaqDNA酶1.0 U,引物0.2μmol/L模板1.2 ng/μL.并利用该优化对金弹等21份金柑属材料进行了ISSR扩增,证实了该体系稳定和可靠性.     

菊属ISSR反应体系的建立及优化

以菊属野生种和不同类型菊花品种为试验材料,通过正交试验对菊属ISSR-PCR反应体系进行初选,在此基础上对体系中的dNTP、引物、Mg2 、TaqDNA聚合酶、模板DNA等最佳浓度进行了筛选,通过稳定性检测,优化了菊花ISSR-PCR反应体系:总体积20μl,DNA模板量60 ng;引物浓度0.5μmol/L;dNTP浓度100μmol/L;Mg2 浓度1.875 mmol/L;Taq聚合酶1 U。     

剑麻ISSR反应体系的建立及其优化

为利用ISSR分子标记进行剑麻遗传多样性分析和种质资源鉴定,分析了剑麻ISSR反应的主要参数对反应体系的影响。结果表明:25μL的反应体系中含150ng的模板DNA、10μLTaq聚合酶MIX、0.5μmol/L引物。优化的反应程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,设定温度(51~60.3℃)退火45s,72℃延伸45s,循环35次;然后72℃延伸10min;筛选到16条适合剑麻扩增的ISSR引物。     

龙眼ISSR反应体系的建立和优化

对影响龙眼ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合龙眼的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μl,其中模板DNA 25ng,引物0.2μmol/L,dNTP 100μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,MgCl2 2.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl;扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min。     

泽泻ISSR反应体系的建立与优化

目的:建立并优化泽泻反应体系和扩增程序,筛选出多态性、重复性较好的ISSR引物,为泽泻种源鉴别以及指纹图谱的构建提供理论基础。方法:利用单因素试验法,对Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度及模板DNA含量这5个PCR反应体系主要成分以及退火温度进行筛选,并利用建立优化的反应体系和扩增程序对以往泽泻文献报道的ISSR引物进行筛选。结果:建立了最佳PCR反应体系:20μL的反应液中含2.0mmol·L~(-1)Mg~(2+),0.4mmol·L~(-1)d NTPs,1.0 U Taq DNA聚合酶,0.4mol·L~(-1)引物,10ng模板DNA,2μL10x Buffer,13.1μL dd H_2O。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性45s。58.9℃退火45s,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min,4℃保存。结论:利用优化的泽泻的反应体系,筛选出15条多态性较好的引物,并对泽泻的21个种源进行ISSR扩增,扩增出的条带清晰、多态性较高,证实了该体系具有较高稳定性、重现性和适用性。此体系也为泽泻种源间的遗传多样性研究以及ISSR分子标记奠定了基础。     

药用植物金花葵ISSR反应体系建立与优化

本试验以药用植物金花葵为研究材料,对金花葵进行体系优化。使用ISSR分子标记技术,最优体系中dNTP浓度为0.10 mmol/L、Taq酶浓度为0.25U、引物浓度为0.20 mmol/L、Mg²⁺浓度为0.40 mmol/L、DNA浓度为50ng。反应步骤为：94℃预变性5min,94℃变性45s,55℃退火55s,72℃延伸1min,40次循环,72℃最后延伸10min,4℃条件下保存。本实验建立的金花葵ISSR反应体系,具有稳定性好、清晰度高、多态性丰富等优点,可为今后金花葵遗传多样性研究奠定实验基础。     

滑叶藤ISSR PCR反应体系建立及优化

 为建立和优化滑叶藤 ISSR PCR反应体系,运用正交试验和单因子试验分析模板DNA,TagDNA聚合酶,Primer,Mg2+和dNTPs 5个因子对滑叶藤ISSR PCR反应影响。结果表明了滑叶藤 ISSR PCR 25μL反应体系中5个因子最佳水平：DNA模板为84ng,TagDNA聚合酶为20u,Primer浓度为08mmol/L,dNTPs浓度为068mmol/L,M2+浓度为24mmol/L。该反应体系为利用ISSR分子标记技术研究铁线莲属植物提供了可靠方法。     

蓝莓ISSR PCR反应体系建立与优化

以蓝莓为材料,通过正交试验设计和单因子优化试验对影响ISSR-PCR扩增结果的5个因素进行探讨,建立了适合蓝莓ISSR-PCR分析的反应体系和扩增程序,即在50μL反应总体积中,包含模板DNA20 ng、ISSR引物0.4μmol.L-1、dNTPs 0.15 mmol.L-1、Mg2+1.5 mmol.L-1、1.25 UTaqDNA聚合酶和10×buffer 5.0μL。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,47℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸7 min。该体系的建立为利用ISSR标记进行蓝莓遗传分析奠定了基础。     

月季ISSR反应体系的优化

以萨曼莎月季为材料,对影响ISSR-PCR扩增的主要影响因子进行了优化,建立了适于月季的ISSR反应体系:25μl反应体积中,1×Buffer、1.5 mmol/L Mg2 、1 U Taq DNA聚合酶、0.6μmol/L引物、0.48 mmol/LdNTPs、20 ng模板DNA;并将该优化体系应用于其他5个ISSR引物和6个月季品种,证实了该体系的适用性和稳定性。     

木荷ISSR反应体系的建立与优化

在利用ISSR技术对木荷的遗传多样性进行研究的试验过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如模板DNA用量、引物用量、牛血清白蛋白浓度T、aq DNA聚合酶用量、4×dNTP浓度、Mg2+浓度以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于木荷ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:10lμPCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%TritonX-100),0.75 U Taq DNA聚合酶,1.5 mmol/L MgCl2,0.2 mol/L 4×dNTP,6 pmol引物,2 mg/ml牛血清白蛋白,10 ng模板DNA;适宜木荷ISSR扩增的退火温度为56.3℃。     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

旨在构建胡椒(Piper nigrum L.)基因组DNA的ISSR-PCR反应体系,以便为海南胡椒属植物的遗传多样性分析研究打下基础。利用单因素随机试验设计,对胡椒ISSR-PCR反应体系中各组分(TaqDNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、引物和Mg2+)的浓度进行优化,同时筛选ISSR-PCR反应的循环数和最适退火温度。确定了最优的ISSR-PCR反应体系为:总体积20μL,其中Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTPs 0.8 mmol/L,引物0.2 mmol/L,Mg2+1.8 mmol/L,模板DNA 50 ng。同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度及最佳循环数。胡椒ISSR-PCR最佳反应程序为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,54.9℃(引物834)退火30 s,72℃延伸45 s,共计35个循环,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存。这一反应体系可成功地应用于海南胡椒属植物的遗传多样性分析。     

大血藤ISSR-PCR反应体系的建立

采用改进的SDS法抽提大血藤基因组DNA,分析了镁离子、dNTP、模板DNA含量、引物浓度、Taq DNA聚合酶量和BSA浓度对大血藤ISSR-PCR扩增结果的影响,建立了稳定的、可重复的大血藤ISSR最佳反应体系:10μL PCR反应体积中,4×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HC l,pH9.0,50 mmol/L KC l,1 g/LTriton X-100),0.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgC l2,0.1 mmol/L dNTP,12 pmol引物,10 ng模板DNA,2 mg/mL牛血清白蛋白。大血藤的最适退火温度为52.4℃。     

金柑组织培养与快速繁殖体系的建立

为了建立金柑(Fortunella japonica (Thunb.) Swingle)组织培养与快速繁殖体系,本研究以金柑胚根、子叶、茎段、叶片等不同外植体为材料,采用器官发生型以及短枝扦插型为主要培养途径,进行金柑的组织培养,研究不同浓度的植物生长调节剂对金柑快速繁殖体系建立的影响以及愈伤组织诱导和分化的最适条件,筛选出诱导愈伤组织形成不定芽的最佳外植体与最适培养基。研究结果表明,金柑诱导愈伤组织形成不定芽的最佳外植体为幼嫩的茎段,诱导金柑子叶形成愈伤组织的最佳培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA+3% 蔗糖+0.7% 琼脂,诱导子叶愈伤组织分化不定芽的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+3% 蔗糖+0.7% 琼脂。由此证明上述组织培养途径是可行的。     

胡萝卜ISSR反应体系优化的研究

以改良CTAB法提取胡萝卜基因组DNA作为ISSR-PCR模板,通过单因素试验建立了一套适合胡萝卜ISSR-PCR的优化的反应体系,即25μL反应液中含10×buffer2.5μL,2.0mmol.L-1Mg2＋,200μmol·L-1dNTPs,Taq酶1.5U,引物0.5μmol·L-1,DNA模板20ng。PCR扩增程序为：94℃预变性4min,94℃变性40s,48～58℃退火45s,72℃延伸2min,进行35个循环,72℃延伸8min,在16℃保存。应用该优化反应体系筛选出了24条有效引物。     

老芒麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立并优化老芒麦ISSR-PCR反应体系和扩增程序,以期为探讨老芒麦种质资源的遗传多样性提供科学依据。[方法]采用正交设计试验和单因素试验相结合的方法对老芒麦的ISSR-PCR的反应体系进行构建和优化,对影响ISSR-PCR扩增效果的Taq酶、模板DNA的浓度、Mg2+、dNTP和引物浓度等因素进行优化,同时对退火温度、循环次数和延伸时间进行筛选。[结果]在25μl体系中各反应物的最适含量为:0.2 mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,1.50 U Taq DNA聚合酶,2.5μl 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl2和40 ng模板DNA;循环次数和延伸时间分别是35次和90 s。[结论]该研究建立并优化了老芒麦ISSR-PCR反应体系,通过2份老芒麦种质对所优化体系得验证,结果显示体系稳定,可用于老芒麦种质资源遗传分析。