海产品中副溶血弧菌的分离与鉴定

副溶血弧菌（Vibrio Paraaemolyticus)是一种致病性嗜盐菌，常引起人类食物中毒，通过对四种不同海产品的检测，发现该菌检出率很高，其中，海虾中的检出率高达90％，海产鱼为70％，贝类为60％，海蟹为40％，平均检出率为65％，动物试验证实，该菌致病性较强。     

基于tlh基因病原副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

为了研究副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的快速分子生物学检测方法,试验以副溶血弧菌特异性tlh基因为分子靶标设计引物,利用环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立病原副溶血弧菌的快速检测方法。结果表明:特异性检测仅副溶血弧菌基因组DNA可扩增出阶梯状条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现明显的绿色阳性反应;而鳗弧菌、河口弧菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌这6种对照病原菌均未出现任何扩增条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现橙色阴性反应;灵敏度检测的最低检测限为42 cfu/mL;对人工染菌的9种水产品检测均可获得阳性扩增结果;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需1 h左右,较传统方法操作简单、耗时短、不需昂贵仪器。说明该方法可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及由该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

创伤弧菌及其危害

创伤弧菌 (Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ)是对人类危害较大的一种细菌。在进口的肉类产品中曾检出过创伤弧菌 ,这引起了本局检疫人员的重视。创伤弧菌对人类引起的感染主要有败血症和软组织感染 ,感染本菌后不出现消化道症状为本菌区别于本属其它菌的一大特点。由于本菌对于糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、肝炎及原因不明的肝功能障碍或其他重病患者的危害相当严重 ,特别是败血症病例 ,死亡率可高达 5 0 %。很早人们就发现 ,有人接触过海水或海产品后容易发生一种原因不明的败血症。创伤弧菌与副溶血弧菌很相似 ,常从海水、鱼类、贝壳类…     

依赖于核酸序列恒温扩增技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立

为建立副溶血性弧菌的快速检测方法,本研究采用依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)技术,以副溶血性弧菌的tlh基因为扩增的靶基因设计特异性引物和探针,建立可快速扩增副溶血性弧菌的NASBA方法.特异性和灵敏度试验结果表明:该NASBA方法对副溶血性弧菌的最小检出量为5.1×102 cfu/mL,高于普通PCR方法,而且与其他种属的菌无任何交叉反应.此外,本研究将副溶血弧菌扩增产物采用通用型核酸扩增物快速检测板进行检测,实现了特异性强的快速副溶血弧菌的检测.该方法对仪器要求低,具有良好的应用前景.     

副溶血弧菌重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法.优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果...     

三斑鲹感染副溶血弧菌的病原分离鉴定及病理组织学观察

正副溶血弧菌最早是由FUJINO等~([1])在1950年从日本发生的一次暴发性食物中毒中发现,并成功分离得到的一种菌。该菌是一种嗜盐性细菌,隶属于弧菌科中的弧菌属,是一种人畜共患病菌。近年来,随着海水养殖业的发展,副溶血弧菌已经成为海水鱼类的主要病原菌之一。李清禄等~([2])从1997     

副溶血弧菌检测技术的研究进展

副溶血弧菌引发食物中毒的规模呈明显的上升趋势,目前已超过沙门氏菌食物中毒,跃居首位。因此需要从多方面加强检测,以防止该菌对食品造成的大面积污染,保证人的身体健康。为此本文全面介绍了副溶血弧菌的各种检测方法,包括:传统方法,免疫学方法,分子生物学技术,传感器技术等,为副溶血弧菌的检测提供理论依据。     

致病性副溶血弧菌三重PCR检测方法的建立和评价

根据副溶血弧菌种特异性基因(tox R)、耐热直接溶血素基因(tdh)和相对耐热直接溶血素基因(trh)为靶基因分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了检测含有溶血素毒力基因的致病性副溶血弧菌的多重PCR方法。3对引物能分别特异性地扩增出368、269、486 bp的目的片段。副溶血弧菌均能扩增出tox R基因,不含溶血素基因的菌株(tdh-/trh-)仅扩增出1条目的片段,而含不同溶血素基因的致病性副溶血弧菌则分别扩增出2条(tdh+/trh-或tdh-/trh+)和3条(tdh+/trh+)特异性条带。检测其他非副溶血弧菌的供试菌,则不出现任何扩增条带。人工模拟样品检测结果显示对致病性副溶血弧菌的最低检测浓度为103CFU/m L。结果表明该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对检测致病性副溶血弧菌有重要意义。     

弧菌颉颃菌的筛选及其在对虾养殖中的初步应用

试验从养殖环境中分离到22株细菌,以副溶血弧菌为病原指示菌,点种法筛选到1株弧菌颉颃菌A4;通过生理生化试验和16S rRNA序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌。抑菌性能试验结果显示,分离菌株对副溶血弧菌、溶藻弧菌及灿烂弧菌均具有较好的颉颃作用。在对虾养殖试验中发现,使用枯草芽孢杆菌制剂2 d后可显著减少水体中的弧菌数量（P＜0.05）,改善对虾生长状态。该菌株可作为益生菌开发成微生态制剂,用于对虾养殖中弧菌病的预防。     

基于tlh和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法

为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

贝类中副溶血弧菌和沙门氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立

为适应进口鲜活水产品的快速检验,有必要建立快速检测多种病原生物的方法。本文针对鲜活水产品中常见的副溶血弧菌和沙门氏菌,设计了特异的荧光引物,建立了检测贝类中这两种细菌的荧光定量PCR体系,并进行了特异性与重复性试验。结果表明,在相同的反应条件下,副溶血弧菌和沙门氏菌均得到了特异性扩增,而阴性对照菌株均未见扩增。副溶血弧菌标准曲线在1.53×105~1.53×109拷贝/μL之间、沙门氏菌标准曲线在4.89×106~4.89×1010拷贝/μL之间有较好的线性关系。与传统的检测方法相比较,该荧光定量PCR方法检测贝类中的副溶血弧菌和沙门氏菌更为快速准确,结果直观,可以满足口岸进口水产品快速检测的需要。     

盐碱水体副溶血弧菌的分离和鉴定

为了明确副溶血弧菌在内陆淡水水体中的分布情况，本试验从查干湖水体中分离得到1株革兰阴性杆菌，命名为A201805S2,对其进行形态观察、生理生化鉴定，并利用PCR方法对其16S rDNA基因序列进行扩增和测序，将测得结果于NCBI上进行BLAST同源性比较。结果显示，该菌株在硫化硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)上为绿色菌落，革兰染色呈红色，两端钝圆，为革兰阴性杆菌；生理生化鉴定结果与副溶血弧菌特性相一致；分离菌与副溶血弧菌16S rDNA基因序列同源性达99%。结果表明，本试验首次从内陆苏打盐碱型淡水水体中分离出副溶血弧菌，为淡水水体副溶血弧菌防控提供数据支持。     

吖啶橙免疫荧光菌团法快速检测鱼类副溶血弧菌的实验研究

副溶血孤菌是常见的食物中毒病原菌,在食品卫生学上具有重要意义。该菌首次由藤野恒三郎于1951年分离获得,近些年来由该菌引起的暴发流行有增无减,多数为食用污染的鱼贝类所引起。据上海1950～1961年的统计,嗜盐菌占查明细菌食物中毒炳原菌的83.8％。目前国内外检测副溶血弧菌主要依靠常规分离培养法,其操作既繁琐又费时     

副溶血弧菌SHJLA株的分离鉴定及致病性分析

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是海洋环境中常见的食源性致病茵。本研究从对虾中分离出1株细菌SHJLA,在TCBS和弧菌显色培养基上分别显示典型的蓝绿色和紫红色的菌落,且其生理生化特性具有典型副溶血弧菌的特性。以SHJLA菌株的基因组为模板。检测副溶血弧菌种特异性基因（tlh、toxR、groEL）均为阳性,gyrB基因序列分析表明SHJLA与副溶血弧茵的亲缘关系最近,同源性达98％～100％;检测副溶血弧菌主要毒力相关基因tdh和T3SS2（VopC2和vcrD2）均为阳性。该菌的神奈川溶血实验为阳性,对小鼠的半数致死量（LD50）为4．8×10^8 cfu／mL。结合SHJLA菌株的形态、生理生化、种特异性基因的检测、gyrB基因序列分析、毒力相关基因的检测以及小鼠半数致死量的测定结果,确定SHJLA是一株携带毒力基因的副溶血弧菌。     

副溶血弧菌及其噬菌体vB_VpS_PG08的分离鉴定

为了分离副溶血弧菌及其噬菌体,并对分离到的噬菌体进行生物学特性分析,采用弧菌选择性培养基进行副溶血弧菌的分离,并进行特异性PCR鉴定。以副溶血弧菌分离株为宿主菌,采用双层平板法进行噬菌体的分离,通过负染法电镜观察噬菌体的形态和大小,并对噬菌体进行裂解谱、最适感染复数(MOI)、一步生长曲线、以及对温度、pH值、紫外线及氯仿的稳定性等生物学特性的研究。结果显示,分离到噬菌体v B_VpS_PG08为长尾噬菌体,对22株副溶血弧菌的裂解率为32%;当最佳MOI是0.01时,噬菌体的效价可以达到2.2×10~9PFU/m L。该噬菌体潜伏期为20 min,暴发期为30 min,暴发量为55;v B_VpS_PG08高温耐受性较弱,p H值稳定性较强,在p H值3～12环境中仍有活性。噬菌体v B_VpS_PG08对紫外线照射敏感,对氯仿不敏感。表明噬菌体v B_VpS_PG08作为一株烈性噬菌体,对副溶血弧菌具有较广泛的裂解作用。本试验将为临床副溶血弧菌的噬菌体控制奠定基础。     

副溶血弧菌毒力因子的研究进展

全球食源性疾病案例呈现逐步上升的严重趋势,而作为沿海地区的首要食物中毒病原菌,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)已经成为引起微生物性食源性疾病之首。本文主要就副溶血弧菌常见的毒力因子的分布和致病机制的研究进展进行详细阐述,对制定该菌引发的食源性疾病的解决方案并有效控制该病原菌的传播扩散具有非常重要的意义。     

副溶血弧菌耐热性直接溶血素的研究进展

副溶血弧菌是存在于海洋水体及海洋生物的致病菌,同时也是引发人食物中毒的重要因素之一。其主要的致病因子是溶血素,其中耐热性溶血素被认为是致病性副溶血弧菌的主要毒力因子。本文就副溶血弧菌耐热性直接溶血素的研究进展作一综述。     

副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与TaqMan探针。toxR和ompW探针5'端分别标记FAM、CY5荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示:该方法的副溶血弧菌和霍乱弧菌最低检测限均达到10 CFU/m L,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌(大肠杆菌O157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌)无交叉反应;批间和批内重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/m L和50 CFU/m L,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/m L和50 CFU/m L。两种细菌在虾肉中富集2 h后的最低检出限均为1 CFU/m L。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,包括DNA提取的整个检测过程可在1至3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。     

副溶血弧菌现场快速检测方法的建立及初步应用

为了实现副溶血弧菌的现场快速筛查,降低副溶血弧菌引起的食品安全问题,保障食品安全,试验利用副溶血弧菌tdh基因建立了可以快速检测水产品中副溶血弧菌的恒温环介导扩增(LAMP)方法,并通过添加钙黄绿素实现现场快速判定水产品中是否存在副溶血弧菌,同时利用建立的方法对螃蟹及贝类共40份水产品进行检测。结果表明:试验建立的方法具有良好的特异性,灵敏度可达7.92×10~(-3) ng/μL,实时浊度仪观察只有副溶血弧菌扩增出曲线,采用钙黄绿素法观察只有副溶血弧菌的扩增体系见到黄绿色。检测方法初步应用结果显示,从1例板蟹和1例蛤蜊中检测到副溶血弧菌核酸,证实2例水产品中存在副溶血弧菌。说明试验建立的方法可用于水产品中副溶血弧菌的现场检测。     

基于toxR基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原副溶血弧菌方法的建立

基于副溶血弧菌toxR基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;在Tm为85℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体;所制作的标准曲线在2.7×108～2.7×102拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.998,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单,耗时短,是副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及食品中针对副溶血弧菌安全检测的有效手段。