检测牛感染犬新孢子虫的TaqMan-MGB Real-time PCR方法的建立

为建立牛感染犬新孢子虫的Real-time PCR检测方法,根据犬新孢子虫Nc2基因保守序列设计特异性检测引物和TaqMan-MGB探针,建立新孢子虫病TaqMan-MGB Real-time PCR检测方法。PCR扩增产物约为150bp,与预期片段大小相符;Real-time PCR扩增表明,Ct值与梯度稀释的阳性质粒模板呈良好的线性关系;当检测牛源性弓形虫、牛环形泰勒和牛巴贝斯等虫种阳性DNA时均为阴性;经3D数字PCR判定,Real-time PCR方法的最低有效检测量为6.41拷贝/μL,灵敏性是常规PCR的1 000倍;重复性试验的组内平均变异系数为1.108%,组间为2.732%;本方法与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499-2013)的检测符合率为100%(46/46)。该Real-time PCR方法可用于早期诊断和日常监测家畜感染犬新孢子虫。     

新疆南疆驴源H3N8亚型EIVHA基因序列分析

为明确新疆南疆驴是否感染马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)及驴源EIV HA基因特征,根据GenBank登录的EIV基因序列,设计合成1对引物,采集新疆南疆地区2个驴屠宰点33份驴肺组织样品,采用RT-PCR扩增驴源EIV HA基因片段,并对扩增产物进行测序与序列分析。结果表明,中国新疆南疆驴源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株HA基因长1 704bp,编码567个氨基酸。同源性分析结果显示,与国内外H3N8亚型EIV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为88.9%~99.9%和88.3%~99.8%,与国内毒株和哈萨克斯坦毒株在一个进化分支内。与GenBank数据库中唯一1个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的比对结果显示,2个毒株裂解位点、糖基化位点、抗原位点和受体结合位点氨基酸完全一致,只是错位2个氨基酸。确定新疆南疆存在驴感染EIV,可能为国内疫情的延续或周边国家传入。     

吉林株犬新孢子虫SAG1基因片段的克隆及蛋白抗原性预测

[目的]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆与序列分析。[方法]从细胞培养的吉林株虫体中提取犬新孢子虫DNA,根据已发表的犬新孢子虫鲥G1基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,采用PCR技术,扩增大新孢子虫SAG1基因片段,并成功克隆到pMD18-T simple载体上,对经PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列分析。[结果]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆后,获得阳性重组质粒。克隆的SAG1基因片段长780bp,编码260个氨基酸,与已发表的美国株犬新孢子虫SAG1基因核苷酸序列（AF132217）的同源性为99．0％,氨基酸序列同源性为98．8％。通过分子生物学软件对翻译水平进行预测,发现吉林株核苷酸序列并不影响氨基酸翻译与蛋白质的表达。[结论]该试验成功克隆重组质粒,为建立犬新孢子虫的高效表达系统奠定了基础。     

芸薹属作物TT8基因鉴定与生物信息学分析

为探明芸薹属作物TT8基因的序列特征和基因组组成,以拟南芥TT8基因为种子序列,利用BLAST工具对芸薹属作物（白菜、甘蓝、甘蓝型油菜、芥菜、黑芥）TT8同源基因进行系统鉴定,对其核苷酸和氨基酸序列进行比较分析。结果表明：在芸薹属作物中共鉴定出7个AtTT8同源基因,其中甘蓝型油菜2个、白菜1个、甘蓝1个、芥菜2个、黑芥1个。芸薹属作物7个TT8基因的基本理化性质、亚细胞定位和蛋白三级结构等均无明显差异;氨基酸序列高度相似,均属bHLH超家族,其中甘蓝型油菜两个TT8同源拷贝分别同白菜与甘蓝聚为一类,亲缘关系紧密;sgRNA分析获得了4条在7个AtTT8同源基因中均高度保守存在的sgRNA位点,推测与TT8基因功能高度相关。最后,本研究还分析43份甘蓝型油菜种质材料的重测序数据,在甘蓝型油菜TT8两个同源基因中共检测到11个多态性位点,包括4个SNP和7个InDel,总频率分别为0.00109和0.00199,均位于5'UTR区。     

大棚金线莲栽培主要病害及防治技术

目的明确云南省金线莲种植基地金线莲灰霉病病原菌。方法采用组织分离法对病原菌进行分离纯化,并完成柯赫氏法则验证。根据病原菌的形态特征、rDNA-ITS和RPB2基因序列明确病菌种类。结果从发病组织分离获得纯培养病原真菌C2L2能导致金线莲发生灰霉病;根据形态特征与分子系统进化分析,将该病原菌确定为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。结论本研究为金线莲病害研究与防控提供参考依据。     

Assessment of vaccination strategies against highly pathogenic avian influenza in China

Vaccination for highly pathogenic avian influenza (HPAI) has been implemented in China for a decade, however, the virus is still present in poultry. A series of recombinant vaccines, Re-1 to Re-7, have been developed and used, and Re-8 will also be used in clinical settings to prevent the prevailing flu strains. The question remains, when can China eradicate the disease? Here, we review the epidemiology of H5 HPAI along with the development, usage and problems of vaccines. Further suggestions for controlling the disease in China are provided.     

盐芥谷胱甘肽过氧化物酶基因（ThGPX8）的克隆与原核表达

【目的】克隆盐芥谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)基因ThGPX8,对其进行序列分析,构建原核表达载体,为进一步研究ThGPX8的结构和功能奠定基础。【方法】以盐芥为材料,利用RT-PCR技术获得其ThGPX8基因的全长cDNA序列;应用生物信息学手段对该基因编码的蛋白结构和系统进化关系进行分析;构建原核表达载体pET-ThGPX8,转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。【结果】获得的ThGPX8基因序列的开放阅读框(ORF)为504bp,编码167个氨基酸,具有GPXs的特征结构域,不是跨膜蛋白;其二级结构主要由无规则卷曲组成,三级结构为二聚体。进化树分析表明,盐芥ThGPX8与拟南芥AlyGPX8、AtGPX8和油菜BnGPX8具有较高的同源性。盐芥ThGPX8与ThGPX6的理化性质存在差异,但具有相似的二级结构和三级结构。将ThGPX8转入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达得到了分子质量约23ku的蛋白,该蛋白在37℃下诱导5h可获得较高的表达量。【结论】获得的ThGPX8基因cDNA序列所编码的蛋白属于植物GPXs家族成员,利用构建的原核表达载体pET-ThGPX8转化E.coli BL21(DE3)获得了融合表达蛋白。     

8 羟基喹啉对泥鳅胚胎的毒性

在泥鳅胚胎发育的胚盘隆起期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期和仔鱼孵出期,分别用不同浓度(1.00×10-4、5.00×10-5、2.50×10-5、1.25×10-5、6.25×10-6mol/L)的8-羟基喹啉进行处理,以胚胎的孵化率及畸形率、仔鱼死亡率及体长的变化等为指标,探讨水体中8-羟基喹啉对鱼类胚胎及仔鱼的毒性作用。结果表明,随着8-羟基喹啉浓度增加,分别在胚盘隆起期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期开始处理时,泥鳅胚胎的孵化率较对照组显著减低,分别减少至83.5%、74%、61%、79%,畸形率较对照组显著增加,分别增加至58%、72%、61%、71%;在仔鱼孵出期开始处理时,泥鳅仔鱼死亡率由3%逐渐增加至100%;处理组的仔鱼体长短于对照组,且有剂量效应关系。因此,8-羟基喹啉对泥鳅胚胎及仔鱼的发育有明显的抑制、致畸、致死作用,表现出明显的毒性作用。     

辣椒 CaTPS8 基因克隆与表达分析

海藻糖-6-磷酸合酶（Trehalose-6-phosphate synthase, TPS）在植物非生物胁迫响应中起着重要的调控作用。以辣椒品种‘强丰101’为材料,对 CaTPS8 基因进行克隆和表达分析。结果表明,该基因CDS的完整开放阅读框为2 553 bp,编码850个氨基酸。生物信息学分析发现,CaTPS8蛋白的分子质量为96 ku,理论等电点为5.65,不稳定系数为48.09,推测为不稳定蛋白。蛋白结构预测显示CaTPS8蛋白包含Glyco_transf_20和 GT20_TPS两个保守结构域,属于亲水性蛋白,没有跨膜结构和信号肽序列。二级、三级结构预测表明该蛋白的结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。系统进化关系分析表明, CaTPS8蛋白与马铃薯和番茄的同源性最高,其相似度分别为87.78%和86.92%,与高粱的同源序列相似度最低,为64.76%。实时荧光定量PCR分析表明, CaTPS8 基因在辣椒花中表达量最高。同时, CaTPS8 基因的表达受到低温的诱导,在处理 3 h时相对表达量最高,约为对照的25倍。此外,IAA、ABA、SA、GA₃和MeJA处理能够抑制 CaTPS8 基因的表达。研究结果为进一步阐明 CaTPS8 基因响应辣椒非生物胁迫的分子机理奠定基础。     

一株植物乳杆菌对脂环酸芽孢杆菌的抑菌活性

【目的】筛选具有抑制脂环酸芽孢杆菌活性的乳酸菌,并对其抑菌活性进行研究,为延长果汁的保质期和提高产品的安全性提供理论基础。【方法】用琼脂扩散法,从50株分离自泡菜的乳酸菌中筛选具有抑制脂环酸芽孢杆菌活性的菌株,研究所获菌株发酵上清液(Cell-free supernatant,CFS)经不同pH(3,4,5,6,7)、温度(40,60,80,100,121℃)和酶(过氧化氢酶、链霉蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶)处理后抑菌活性的变化;通过气相色谱-质谱分析乳酸菌代谢物中的组成成分;利用扫描电镜观察CFS处理后脂环酸芽孢杆菌的形态变化;将乳酸菌应用于苹果汁的发酵,并测定发酵过程中乳酸菌和脂环酸芽孢杆菌生长及6种有机酸含量的变化情况。【结果】筛选得到1株具有较好抑菌活性的植物乳杆菌(L10),其代谢物抑菌活性呈pH依赖性,具有温度和过氧化氢酶稳定性,但蛋白酶水解会降低其抑菌活性。植物乳杆菌L10代谢物中的成分主要是有机酸,并且含有环(亮氨酸-脯氨酸)和环(甘氨酸-脯氨酸)两种环二肽。CFS通过对脂环酸芽孢杆菌的细胞壁和细胞膜造成严重损害,导致细胞破裂,达到杀菌的目的。植物乳杆菌L10能够抑制苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的生长,并且发酵后主要有机酸的含量发生显著变化(P0.05)。【结论】植物乳杆菌L10可以产生有机酸、细菌素等抑菌物质来杀灭脂环酸芽孢杆菌,可以应用于果汁的发酵及生物保存。     

猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建及其免疫效果

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因疫苗,并对其免疫效果和安全性进行研究。【方法】将PCV2ORF2基因从pMD-ORF2*质粒(包含PCV2 SCH A株ORF2基因)酶切回收,插入到真核表达载体pcD-NA-3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA-ORF2,对该质粒进行酶切和PCR鉴定。将pcDNA-ORF2转染IBRS-2细胞,进行Western blotting检测。将构建好的pcDNA-ORF2制成核酸疫苗,按100μg/只腿部肌肉注射免疫Balb/c小白鼠,同时设pcDNA-3.1(+),PCV2全毒和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第14天和56天采血,用ELISA法检测抗体;于首免后第56天,采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)对小鼠的细胞免疫进行检测。取首免后56 d小鼠的心肝、脾、肺、肾和脑等实质器官,采用PCR方法检测pcDNA-ORF2核酸疫苗的安全性。【结果】Western blotting结果显示,pcDNA-ORF2构建成功,并在哺乳动物细胞中获得表达。pcDNA-ORF2核酸疫苗能诱导小鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫应答。PCV2ORF2基因未整合到小鼠染色体上。【结论】pcDNA-ORF2可诱导小鼠产生免疫反应,其对小鼠是安全的。     

小鼠SOCS3基因真核表达载体的构建及其对3T3-L1细胞凋亡的影响

【目的】探讨SOCS3对3T3-L1细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,用RT-PCR扩增SOCS3基因,将其克隆至pMD18-T Simple,构建pMD18-T-SOCS3重组质粒,经测序验证后,以pMD18-T-SOCS3为模板扩增SOCS3基因,将其克隆至pEGFP-N1,构建真核重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,测序正确后,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3转染3T3-L1细胞,荧光下观察GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3mRNA和蛋白的表达,观察细胞凋亡的变化。【结果】测序表明,pMD18-T-SOCS3和pEGFP-N1-SOCS3的核苷酸序列正确率为100%;在荧光显微镜下发现,脂质体组和SOCS3组均有GFP的表达;RT-PCR和Westernblotting检测表明,3T3-L1细胞中SOCS3mRNA表达显著提高(P<0.05);Hoechst 33258染色发现,SOCS3组的细胞凋亡显著;Bax和c-myc基因的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),bcl-2和mcl-1基因表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】SOCS3对脂肪细胞凋亡的发生有促进作用。     

肠炎沙门菌噬菌体vB_SalP_QS的生物学特性及治疗小鼠沙门菌肠道感染的研究

为探索针对耐药沙门菌的噬菌体治疗方法,以沙门菌SE-21为宿主菌,从污水中分离得到一株烈性噬菌体并命名为vB_SalP_QS。在鉴定vB_SalP_QS生物学特性的基础上,对vB_SalP_QS和vB_SalP_SE29混合噬菌体治疗由沙门菌SE-21引起小鼠肠炎的治疗效果进行评价。结果表明：1）电镜观察可见该噬菌体属于有尾病毒目（Caudovirales）,其效价为8×10⁸ PFU/mL。2）vB_SalP_QS的最佳感染复数（MOI）为0.01,潜伏期为40 min,裂解期为50 min。温度为4~60 ℃具有较好的活性,在pH 4~pH 10范围内非常稳定。平板点滴法试验表明vB_SalP_QS可以裂解17株沙门菌,裂解率为44.7%。3）噬菌体vB_SalP_QS的全基因组测序分析显示,噬菌体vB_SalP_QS全长42 293 bp,GC含量为49%,共含有72个开放阅读框,且不含有溶源性、毒力因子及整合酶基因。4）小鼠体内治疗试验显示,宿主菌SE-21对小鼠最小致死量为5×10⁸ CFU/mL,感染小鼠经vB_SalP_QS （100 μL 1×10⁷ PFU/mL）和vB_SalP_SE29 （100 μL 1×10⁷ PFU/mL）混合治疗后存活率为100%,单独用vB_SalP_QS治疗组 （200 μL 1×10⁷ PFU/mL）的小鼠存活率为80%,单独用vB_SalP_SE29治疗组（200 μL 1×10⁷ PFU/mL）的小鼠存活率为70%,对照组全部死亡。5）病理组织观察表明,混合噬菌体可以有效杀灭沙门菌SE-21的同时,还能更好地保护小鼠肠绒毛,可显著提高感染SE-21的小鼠存活率。综上,噬菌体vB_SalP_QS具有良好的酸碱稳定性、热稳定性以及安全性,混合噬菌体联合治疗效果优于噬菌体单一治疗。本研究为噬菌体制剂治疗沙门菌感染提供了重要依据,也为混合噬菌体鸡尾酒疗法的临床应用奠定基础。     

秦川牛 MYH8基因多态性及其与生长性状的关联分析

为研究秦川牛MYH8基因的多态性及其与秦川牛生长性状的关联性,选取163头健康的30月±2月龄秦川牛,采用DNA测序技术发现MYH8基因外显子上的SNP位点,并以PCR-RFLP技术分析秦川牛群MYH8基因型,研究其遗传多样性,再通过SPSS 19.0软件分析SNP位点与秦川牛体尺性状和胴体性状的关联性。研究结果表明,在MYH8基因第33外显子上存在3个SNP位点,分别在基因序列26 064、26 094和26 100bp 3处,且26 064bp处(TC)为同义突变,26 094bp处(TC)为错义突变,26 100bp处(CG)为错义突变。关联分析显示,C26100G突变发生在体斜长指标,表现为GG基因型个体的群体均值显著高于GC、CC基因型个体(P0.05);而其他突变中不存在显著性差异。某些基因型(T26064C突变处TC基因型和T26094C突变处CT基因型)可能为优势基因型,但还需通过更多个体验证。说明:MYH8基因对秦川肉牛生长性状存在一定影响。     

TLR18基因在鲤感染CyHV-3中的表达模式及信号通路

以抗病镜鲤选育系F4和德国镜鲤选育系为实验材料,通过RT-PCR技术确定鲤受CyHV-3感染过程两组鱼脾脏组织中TLR18、接头蛋白MyD88及相应配体TRAF6、下游因子IRF5及P65基因的表达模式,并分析其在抗病镜鲤选育系F4中的相关抗病机制。结果显示： TLR18、MyD88、TRAF6、IRF5基因在两组鱼间均呈先上升后下降并趋于平稳趋势,在48h达到最高,而P65基因在未选育组呈先上升后下降并恢复初始水平趋势,在48h达到最高,在选育组呈下降后恢复初始水平趋势。在未感染CyHV-3时,TLR18与IRF5基因相对表达量在选育组极显著低于未选育组,MyD88、TRAF6与P65基因相对表达量在选育组极显著高于未选育组;到CyHV-3感染早期,TLR18与P65基因相对表达量在选育组极显著低于未选育组,MyD88、TRAF6及IRF5基因相对表达量在选育组显著高于未选育组。推测在CyHV-3感染过程中,TLR18基因通过依赖MyD88途径产生IRF5基因清除病毒的同时激活NF-κB信号通路,且选育组较未选育组通过产生较多IRF5基因清除病毒,而未选育组较选育组显著激活NF-κB信号通路产生相关炎症因子,这可能与选育组抗病性及抗病机制有关。该结果不仅验证了选育组在机体基础水平及先天免疫过程中对CyHV-3抗性的增强,还为深入研究选育组抗病机制及鱼类TLRs在病毒感染过程中的作用及其相关信号通路奠定基础。     

耐热鸡新城疫V4苗对高母源抗体雏鸡的口服免疫试验

用两个剂量分别以拌料和连续添加的方式，对具新城疫高母源抗体的雏鸡进行耐热新城疫弱毒Ｖ４苗的口服免疫试验，并用Ⅳ系苗滴鼻滴眼免疫作对照．血清ＨＩ抗体测定结果显示，４个试验组的ＨＩ抗体水平在全程的８次测定中均较低且消长平缓，攻毒试验显示试验组与对照组相当，均具有较高的保护率．在进行免疫试验的同时，对试验鸡进行称重，经Ｖ４苗免疫的试验组的体重比对照组增加．     

内生细菌EDR2的鉴定及其对油菜菌核病的防治

【目的】明确内生细菌EDR2菌株的分类地位以及对油菜菌核病的防治作用,为该菌株的进一步应用奠定基础。【方法】采用皿内和温室盆栽试验,测定菌株EDR2对油菜菌核病菌菌丝生长和菌核萌发的抑制作用以及对病害的防治效果;并结合菌体形态观察、生理生化特性测定以及16SrDNA序列分析确定该菌株的分类地位。【结果】内生细菌EDR2菌株能够有效抑制油菜菌核病菌的菌丝生长,并可导致菌丝出现畸形、细胞质外渗,同时其还对病菌的菌核萌发具有较强的抑制作用,培养原液的抑制率可达到96.6%。温室盆栽试验结果表明,菌株EDR2的培养原液和无菌培养滤液对苗期油菜菌核病均有良好的防治效果,其防效都在80%以上;菌株EDR2的喷施时间可影响其防治效果,其中以接种病菌前1d喷施防治效果最好,可达到95.4%;培养原液及不同倍数稀释液对病害的防治效果明显不同,随着稀释度的增加,其生防效果降低。菌株EDR2对供试的16种植物病原菌的菌丝生长均表现出一定的抑制作用,表现出较广的抑菌谱。结合形态和培养特征、生理生化特性及分子生物学鉴定结果认为,内生细菌EDR2属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。【结论】综合皿内及温室盆栽试验结果认为,内生枯草芽孢杆菌EDR2是1株对油菜菌核病具有较好防治潜力和开发前景的生防菌株。     

基于Landsat 8的云南松光谱端元选择与评价研究

以云南松为研究对象, 调查昆明市主城区周围61个样点, 选择3块代表性样地, 基于Landsat 8影像, 采用纯净像元指数(PPI)、连续最大角凸锥(SMACC)和几何顶点的端元提取方法, 利用样区1提取的云南松端元波谱对样区2和3进行分类。以外业调查数据提取的平均端元为真值, 结合波谱角填图(SAM)分类结果, 对比分析不同的端元提取方法。结果表明:研究样区2基于PPI、SMACC和几何顶点端元提取的分类结果整体精度分别为85.00%、35.00%和85.00%;研究样区3基于PPI、SMACC和几何顶点端元提取的分类结果整体精度分别为83.33%、16.67%和75.00%。基于PPI提取的云南松端元平均波谱曲线与真实地表的云南松波谱曲线最为相似, 可用于今后基于Landsat8数据的云南松波谱端元提取和混合像元分解。     

嗜水气单胞菌性鲫败血症的盐酸沙拉沙星用药方案研究

【目的】研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代学、药效动力学联合参数,确定盐酸沙拉沙星治疗鲫鱼细菌性疾病的防耐药突变用药方案。【方法】测定盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的体外最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)、抗菌后效应(PAE)、防耐药突变浓度(MPC)和防耐药突变选择窗(MSW);给鲫经口灌服不同剂量(20,30,40mg/kg)的盐酸沙拉沙星,于给药后0.5,1,2,4,6,8,10,12,16,24,48h取血清及肌肉样品,研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代动力学,然后结合药代动力学和药效动力学结果,确定盐酸沙拉沙星防治嗜水气单胞菌引起的鲫鱼细菌性败血症的合理给药方案。【结果】盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的MIC为0.5μg/mL,MBC为2.0μg/mL,MPC为2.5μg/mL,MSW为0.5~2.5μg/mL。按20,30,40mg/kg剂量给鲫鱼经口灌服盐酸沙拉沙星后,鲫鱼体内的血药质量浓度大于MPC的维持时间分别为0,4.0,24.0h;AUC24/MIC分别为8.44,78.20,164.96;Cmax/MIC分别为4.496,6.662,15.294。【结论】40 mg/kg灌服剂量能使鲫的血药浓度维持在MPC以上的时间≥(24-PAE)h、AUC24/MIC≥100或Cmax/MIC8,因此建议盐酸沙拉沙星防治嗜水气单胞菌引起的鲫鱼细菌性败血症的防突变用药方案为:给药剂量40mg/kg,每日给药1次,休药期不低于10d。