广西罗非鱼源无乳链球菌耐药性及其四环素耐药基因检测

[目的]研究分析广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药性及其四环素类耐药基因,为指导罗非鱼无乳链球菌病的临床用药和揭示其耐药机制提供参考依据.[方法]采用二倍稀释法测定8种抗生素对广西罗非鱼源无乳链球菌的最小抑菌浓度(MIC),运用PCR检测菌株的四环素类耐药基因(tetM、tetO、tetL和tetS)携带情况,并以体外诱导法测定罗非鱼源无乳链球菌对多西环素耐药性的获得速率.[结果]37株广西罗非鱼源无乳链球菌对氨苄青霉素、多西环素、红霉素和土霉素均敏感,对硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶不敏感(已产生耐药性);仅从8株菌株中检出tetM基因,检出率21.6%(8/37),而tetO、tetL和tetS基因的携带率均为0,即广西罗非鱼源无乳链球菌仅存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS-两种耐药基因型.经多西环素连续8代的体外传代诱导,6株携带tetM基因的罗非鱼源无乳链球菌MIC由0.24μg/mL上升至3.91μg/mL,即耐药性获得速率约16倍.PCR检测结果显示,各传代菌株均携带有tetM基因,且各传代菌株间的核甘酸相似性为100.0%.[结论]广西罗非鱼源无乳链球菌存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS两种耐药基因型,对氨苄青霉素、多西环素、红霉素和土霉素仍较敏感,对硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶已产生耐药性.携带tetM基因的罗非鱼源无乳链球菌经体外诱导后对多西环素的耐药性大幅度提高,说明未达有效抑菌浓度时极易诱导无乳链球菌产生耐药性.     

2007-2012年中国罗非鱼无乳链球菌流行菌株血清型分析

采用PCR血清型鉴定方法,对2007-2012年从广西、广东、海南、福建和云南等地养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus中分离获得的168株无乳链球菌Streptococcus agalactiae流行菌株的血清型进行分析。结果表明：有159株为Ⅰa血清型,6株为Ⅰb血清型,3株为Ⅲ血清型。各区域流行菌株血清型也存在差异：从广西自治区7个地区50个养殖场的罗非鱼中分离的61株无乳链球菌中,有54株为Ⅰa型,4株为Ⅰb型,3株为Ⅲ型;从广东省10个地区59个养殖场的罗非鱼中分离的64株无乳链球菌中,有63株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从海南省5个地区26个养殖场的罗非鱼中分离的33株无乳链球菌中,有32株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从福建省漳州6个养殖场的罗非鱼中分离的6株和从云南省文山4个养殖场的罗非鱼中分离的4株均为Ⅰa型。研究表明,2007-2012年中国罗非鱼链球菌病流行菌株血清型存在Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3种血清型,Ⅰa型为主要血清型,研究结果可为准确分析中国罗非鱼链球菌病流行规律和特点提供数据,为该病防治及疫苗候选菌株筛选提供理论基础。     

2007—2012年中国罗非鱼无乳链球菌流行菌株血清型分析

采用PCR血清型鉴定方法,对2007—2012年从广西、广东、海南、福建和云南等地养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus中分离获得的168株无乳链球菌Streptococcus agalactiae流行菌株的血清型进行分析。结果表明:有159株为Ⅰa血清型,6株为Ⅰb血清型,3株为Ⅲ血清型。各区域流行菌株血清型也存在差异:从广西自治区7个地区50个养殖场的罗非鱼中分离的61株无乳链球菌中,有54株为Ⅰa型,4株为Ⅰb型,3株为Ⅲ型;从广东省10个地区59个养殖场的罗非鱼中分离的64株无乳链球菌中,有63株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从海南省5个地区26个养殖场的罗非鱼中分离的33株无乳链球菌中,有32株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从福建省漳州6个养殖场的罗非鱼中分离的6株和从云南省文山4个养殖场的罗非鱼中分离的4株均为Ⅰa型。研究表明,2007—2012年中国罗非鱼链球菌病流行菌株血清型存在Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3种血清型,Ⅰa型为主要血清型,研究结果可为准确分析中国罗非鱼链球菌病流行规律和特点提供数据,为该病防治及疫苗候选菌株筛选提供理论基础。     

无乳链球菌对罗非鱼粘液的粘附特性

利用间接ELISA方法研究罗非鱼不同部位的粘液、作用时间、温度、p H及盐度等因子对无乳链球菌粘附作用的影响。结果表明:无乳链球菌对罗非鱼不同部位粘液的粘附能力受温度、粘附时间和p H值影响较大,受盐度影响较小。孵育温度为35℃、孵育时间为120 min时,无乳链球菌对肠道粘液的粘附能力最强,粘附量达到4.052×10~7cfu·m L~(-1);其次是体表粘液,粘附量为6.480×10~6cfu·m L~(-1);鳃粘液的粘附能力最弱,为2.825×10~6cfu·m L~(-1)。当孵育时间少于180 min时,粘附量与孵育时间呈正相关;粘附量在35℃下孵育180 min时,趋于饱和,达到5×10~8cfu·m L~(-1)。无乳链球菌对不同部位粘液粘附的最适p H值不同,肠道粘液、体表粘液和鳃粘液粘附力最强的p H值分别为5.0,7.0和8.0。     

罗非鱼无乳链球菌拮抗菌的分离、鉴定及多样性分析

采用径向扩散法筛选对罗非鱼致病性无乳链球菌具有拮抗作用的益生菌,利用16S r DNA对拮抗菌进行鉴定,构建系统发育树对拮抗菌的多样性进行分析,并通过腹腔注射法测定其对罗非鱼的安全性。结果表明,从8个采样点共分离细菌1 759株,其中59株对无乳链球菌具有较强的拮抗作用,抑菌圈直径为10.6mm~30.8 mm,平均21.9 mm;16S r DNA分子鉴定及系统进化树分析显示,59株拮抗菌分为5属8个种,其中芽孢杆菌属(Bacillus)45株、假单胞菌属(Pseudomonas)5株、肠球菌属(Enterococcus)2株、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)2株和葡萄球菌属(Staphylococcus)5株。鱼体安全性试验显示,有22株拮抗菌对罗非鱼不具有致病性,可作为防治罗非鱼无乳链球菌病的备选菌株。     

福建红罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及其分子特征

为探讨2017年福建省漳州市某养殖场红罗非鱼出现疾病的发病原因,并为该病的有效防治提供理论基础,以常规方法从患病红罗非鱼Oreochromis mossambicus×O.niloticus脑组织中分离优势菌株,采用形态观察和16S rRNA基因序列分析等方法对该优势菌进行鉴定,通过分子血清型、MLST和毒力基因等分型方法对分离株进行了分子特征分析,并采用K-B纸片扩散法检测分离株对26种抗生素的敏感性。结果表明:从病鱼脑组织中分离获得1株具致病力的不溶血(即γ溶血)无乳链球菌,该分离株是Ⅰa-ST7型,其毒力基因型为bac~+-bca~+-cfb~+-hylB~+-fbsA~+-fbsB~+-lmb~--scpB~--cpsE~+-sip~+,且对头孢类药物、强力霉素、氨苄青霉素等13种药物敏感,对氟罗沙星、青霉素G、多粘菌素B等4种药物中度敏感,而对新霉素、庆大霉素、卡那霉素等9种药物耐药。本研究结果可为福建红罗非鱼无乳链球菌病的疫病监测、疫苗研制和药物防治等研究提供基础数据。     

福建红罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及其分子特征

为探讨2017年福建省漳州市某养殖场红罗非鱼出现疾病的发病原因,并为该病的有效防治提供理论基础,以常规方法从患病红罗非鱼Oreochromis mossambicus×O.niloticus脑组织中分离优势菌株,采用形态观察和16S rRNA基因序列分析等方法对该优势菌进行鉴定,通过分子血清型、MLST和毒力基因等分型方法对分离株进行了分子特征分析,并采用K-B纸片扩散法检测分离株对26种抗生素的敏感性。结果表明:从病鱼脑组织中分离获得1株具致病力的不溶血(即γ溶血)无乳链球菌,该分离株是Ⅰa-ST7型,其毒力基因型为bac⁺-bca+-bca⁺-cfb+-cfb⁺-hylB+-hylB⁺-fbsA+-fbsA⁺-fbsB+-fbsB⁺-lmb+-lmb^--scpB--scpB^--cpsE--cpsE⁺-sip+-sip⁺,且对头孢类药物、强力霉素、氨苄青霉素等13种药物敏感,对氟罗沙星、青霉素G、多粘菌素B等4种药物中度敏感,而对新霉素、庆大霉素、卡那霉素等9种药物耐药。本研究结果可为福建红罗非鱼无乳链球菌病的疫病监测、疫苗研制和药物防治等研究提供基础数据。     

福建红罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及其分子特征

为探讨2017年福建省漳州市某养殖场红罗非鱼出现疾病的发病原因,并为该病的有效防治提供理论基础,以常规方法从患病红罗非鱼Oreochromis mossambicus×O.niloticus脑组织中分离优势菌株,采用形态观察和16S rRNA基因序列分析等方法对该优势菌进行鉴定,通过分子血清型、MLST和毒力基因等分型方法对分离株进行了分子特征分析,并采用K-B纸片扩散法检测分离株对26种抗生素的敏感性。结果表明:从病鱼脑组织中分离获得1株具致病力的不溶血(即γ溶血)无乳链球菌,该分离株是Ⅰa-ST7型,其毒力基因型为bac~+-bca~+-cfb~+-hylB~+-fbsA~+-fbsB~+-lmb~--scpB~--cpsE~+-sip~+,且对头孢类药物、强力霉素、氨苄青霉素等13种药物敏感,对氟罗沙星、青霉素G、多粘菌素B等4种药物中度敏感,而对新霉素、庆大霉素、卡那霉素等9种药物耐药。本研究结果可为福建红罗非鱼无乳链球菌病的疫病监测、疫苗研制和药物防治等研究提供基础数据。     

双重 PC R检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

根据罗非鱼源无乳链球菌16S rRNA 基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1305 bp和121 bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16S rRNA 基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05＆#215;10^2 CFU ;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA ,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。     

罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立

本文利用终浓度为0.5%(v/v)的甲醛在4℃条件下灭活24 h制备灭活的罗非鱼无乳链球菌,用其作为抗原对兔进行免疫制备兔抗无乳链球菌血清,以无乳链球菌抗兔血清作为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig G作为酶标二抗,建立并优化了无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法。此检测方法的抗原最适包被浓度为1×10~7 CFU/mL,一抗最适工作浓度为1∶100(v/v),二抗最适工作浓度为1∶2 000(v/v),最低检测限为1×10~4 CFU/mL。利用此法对发病的罗非鱼进行检测,阳性检出率为80%,与本试验选取的指示菌株均无交叉反应。     

罗非鱼源Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明,罗非鱼Oreochromis niloticus Ia和Ib血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力,为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因,在提取罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白,并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能。结果表明:在2D-DIGE电泳上,Ia和Ib两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点,对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白,这些蛋白主要与氧化还原反应、代谢与能量前体物产生、糖代谢反应等生物学过程有关,主要参与糖解和糖异生作用、丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路;对蛋白功能的预测表明,GAPGH、半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关。本研究首次证实,罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白,部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关,这可能与链球菌免疫原性有直接关系,但需要进一步地研究和证实。     

广西罗非鱼和卵形鲳鲹海豚链球菌的生化特性及基因多态性分析

对2006—2011年从广西养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus和卵形鲳鲹Trachinotus ovatus中分离的链球菌菌株进行生理生化和二重PCR鉴定,并利用随机扩增多态性DNA标记(RAPD)对经鉴定为海豚链球菌Streptococcus iniae的临床菌株进行生化特性及基因多态性分析。结果表明:经鉴定共有22株临床分离菌株为海豚链球菌;RAPD分析发现,所有菌株的电泳结果均在750 bp处出现特异性条带,且带型相同;结合Bachrach的研究结果,推测本试验中所分离的22株海豚链球菌的血清型均为Ⅰ型。本研究结果可为防治鱼类海豚链球菌病提供科学依据。     

广西罗非鱼和卵形鲳鲹海豚链球菌的生化特性及基因多态性分析

对2006-2011年从广西养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus和卵形鲳鲹Trachinotus ovatus中分离的链球菌菌株进行生理生化和二重PCR鉴定,并利用随机扩增多态性DNA标记( RAPD)对经鉴定为海豚链球菌Streptococcus iniae的临床菌株进行生化特性及基因多态性分析。结果表明：经鉴定共有22株临床分离菌株为海豚链球菌; RAPD分析发现,所有菌株的电泳结果均在750 bp处出现特异性条带,且带型相同;结合Bachrach的研究结果,推测本试验中所分离的22株海豚链球菌的血清型均为Ⅰ型。本研究结果可为防治鱼类海豚链球菌病提供科学依据。     

2011～2012年广西罗非鱼食源性致病菌及其药敏特性调查

[目的]了解广西罗非鱼食源性致病菌的种类及其药敏特性,为研究制定罗非鱼食源性疾病的综合防控措施提供参考依据.[方法]对2011～2012年采自广西罗非鱼主产区养殖场及市售罗非鱼样品（200份）进行沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、无乳链球菌、海豚链球菌和致病性嗜水气单胞菌等9种重要食源性致病菌分离,采用Biolog自动微生物鉴定系统对分离获得的食源性致病菌进行鉴定,并参照美国临床实验室标准化研究所推荐的纸片琼脂扩散（K-B）法进行药敏试验.[结果]所检测的9种食源性致病菌中除了未检出金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌外,其他6种食源性致病菌均有检出.养殖场罗非鱼样品的无乳链球菌和致病性嗜水气单胞菌检出率较高,分别为7.5％和5.0％,海豚链球菌、沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的检出率分别为3.3％、2.5％、1.7％和0.8％;市售罗非鱼样品仅检出无乳链球菌、海豚链球菌、致病性嗜水气单胞菌和沙门氏菌,检出率分别为2.5％、1.3％、1.3％和1.3％.检出的食源性致病菌对常用抗菌药物表现出不同的敏感药物谱和耐药谱,以对头孢哌酮的敏感率最高,达56.7％;对青霉素、新霉素和林可霉素的耐药率最高,均为63.3％.[结论]广西罗非鱼携带有以无乳链球菌和致病性嗜水气单胞菌为主的多种食源性致病菌,且检出的致病菌均存在多重耐药性.     

猪链球菌2型广西分离株毒力基因表型分析

【目的】了解广西致病性猪链球菌2型（SS2）菌株的毒力基因表型,为广西SS2的防制提供分子生物学依据。【方法】应用PCR技术对分离自发病猪的SS2菌株进行荚膜多糖糖基转移酶基因（CPS2J）、溶菌酶释放蛋白基因（MRP）、细胞外蛋白因子基因（EF）、溶血素基因（SLY）和谷氨酸脱氢酶基因（GDH）5种毒力基因检测。【结果】60%菌株的基因表型为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋/GDH＋,30%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH-,10%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH＋。【结论】CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋是广西致病性SS2菌株的主要基因表型,与从江苏、四川SS2疫区分离获得的菌株基因表型一致,今后应加强对SS2毒力基因的监测,严防SS2疫情暴发。     

广西昭平县2013-2016年尿石症住院患者的流行病学调查

目的 总结广西昭平县尿石症的流行病学特点.方法 收集2013年1月-2016年12月854例尿石症住院患者临床资料,分析流行病学特点.结果 854例患者中,男529例,女325例,年龄7～ 100岁,平均(51.0±19.o)岁;高峰发病年龄为40～69岁(67.2％),男女之比为1.63∶1.尿石症好发于上尿路,其中输尿管结石占53.7％.结论 该地区尿石症好发于中老年男性,其中半数以上为输尿管结石.     

Molecular epidemiology,characterization of virulence factors and antibiotic resistance profile of Streptococcus agalactiae isolated from dairy farms in China and Pakistan

Streptococcus agalactiae is one of the most common pathogens that cause bovine mastitis worldwide. Identifying pathogen prevalence and virulence factors is critical for developing prevention and control approaches. Herein, 1 161 milk samples from various dairy farms in China (n=558) and Pakistan (n=603) were collected between 2019–2021 and were subjected to S. agalactiae isolation. Prevalence, serotyping, virulence genes, and antibiotic-resistant genes of S. agalactiae were evaluated by PCR assay. All isolates were characterized for haemolysis, biofilm production, cytotoxicity, adhesion, and invasion on bovine mammary epithelial cells. The prevalence of S. agalactiae-induced mastitis in cattle was found to be considerably higher in Pakistan than in China. Jiangsu and Sindh provinces had the highest area-wise prevalence in China and Pakistan, respectively. Serotypes Ia and II were prevalent in both countries, whereas serotype III was found only in Pakistan. Moreover, all isolates tested positive for PI-2b gene but negative for PI-1 and PI-2a genes. All isolates harboured cfb, cylE, hylB, and fbsB virulent genes, whereas many of them lacked bibA, rib and bca. However, the absence of bac and scp genes in Chinese isolates and cspA in Pakistani isolates was noted, while spb1 and lmb were not detected in isolates of both countries. Pakistani isolates, particularly serotype Ia-positive, had a considerably higher ability to produce biofilm, haemolysis, cytotoxicity, adhesion, and invasion than Chinese isolates. Most of the isolates were phenotypically resistant to tetracycline, erythromycin, and clindamycin and genotypic resistance was confirmed by the presence of ermA, ermB, tetM and tetO genes. Our study highlights the antimicrobial resistance profile and virulence-related factors contributing to the epidemiological spread of mastitis-causing S. agalactiae in China and Pakistan. The findings may facilitate future studies designed to develop improved treatment and control strategies against this pathogen.