精喹禾灵酶联免疫吸咐分析（ELISA）研究

 【目的】制备精喹禾灵的特异性抗体并建立精喹禾灵的间接竞争ELISA测定方法。【方法】精喹禾灵在碱性条件下水解合成了半抗原精喹禾灵酸,并与载体蛋白BSA和OVA偶联,分别合成了免疫抗原和包被抗原,偶联比分别为29.23和7.87。将Hapten-BSA免疫兔子获得多克隆抗体。【结果】抗血清的效价为200 000。经酶联免疫吸附反应分析（ELISA）测定,精喹禾灵的抑制中浓度（IC50）为0.03495 μg•ml-1,最低检测浓度（IC10）为0.002 μg•ml-1,检测范围为0.002～0.5 μg•ml-1。其与结构相似的物质几乎没有交叉反应,表明该方法具有很强的特异性,且在水样中的添加回收率为89.02%～108.88%。【结论】成功获得精喹禾灵特异性抗体并建立了水样中精喹禾灵农药残留的ELISA测定方法。     

植酸酶鼠源多克隆抗血清的制备

 【目的】制备灵敏性高、特异性强的植酸酶多克隆抗体。【方法】将初步纯化的麸皮植酸酶蛋白经凝胶电泳鉴定纯度后,按50 μg蛋白/只?次免疫Balb/C小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后一次免疫60 d后,摘眼球取血,制备抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。【结果】凝胶电泳的麸皮植酸酶只有一个条带;血清植酸酶抗体效价达1×104;半数抑制浓度达148.87 ng?mL-1。此抗血清对市售的普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩的微生物植酸酶的半数抑制浓度分别达到165.59 、163.80和166.51 ng?mL-1,交叉反应率分别为89.85%、90.88%和89.41%。100℃煮沸5 min后的麸皮、市售普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩酶半数抑制浓度分别为2 871.34、5 208.85、7 914.12和5 804.24 ng?mL-1,交叉反应率分别为5.18%、2.86%、1.88%及2.56%。【结论】制备出了具有高效价、高灵敏度和特异性的鼠源植酸酶多克隆抗体,为植酸酶单克隆抗体制备及植酸酶ELISA检测试剂盒研制奠定了基础。     

己烯雌酚特异性抗体的制备

【目的】制备抗己烯雌酚（DES）的高亲和力特异性抗体,建立检测DES的间接竞争ELISA标准曲线,为进一步研究DES快速检测试剂盒打下基础。【方法】应用DES人工免疫抗原免疫新西兰大白兔,采集抗DES的特异性抗血清,用KCjunior软件进行4参数非线性回归,建立检测DES的间接竞争ELISA标准曲线,各药物浓度在同一批次酶标板中做4次重复,共做4个批次对标准曲线进行评价,用己烷雌酚（HEX）、双烯雌酚（DIEN）、雌二醇（E2）、乙炔雌二醇（EE2）和L-酪氨酸（Tyr）来评价抗体的特异性。【结果】5只家兔免疫产生了抗DES的特异性抗血清,其中4号家兔抗血清效价达到了1﹕4 096 000竞争抑制效果最好,工作稀释浓度为1﹕1 024 000时,线性范围在0.01～50 μg•L-1,标准曲线的IC50在0.71～1.0 μg•L-1,R2在0.9952～0.9978。获得各标准浓度下B/B0的批内变异系数在0.52%～22.48%,批间变异系数在2.64%～19.51%。交叉反应试验表明,4号家兔抗血清对与DES结构相似的人工合成二苯乙烯类雌激素药物己烷雌酚（HEX）和双烯雌酚（DIEN）的交叉反应率分别为8.5%和38.5%,与天然雌激素类药物雌二醇（E2）和乙炔雌二醇（EE2）以及L-酪氨酸（Tyr）的交叉反应均小于0.001%。【结论】本文报道的抗体特异性好、亲和力高,可满足目前中国动物性食品安全评价检测的需要,为研究组织中DES残留检测的ELISA方法及其开发DES快速检测试剂盒奠定了基础。     

抗苦马豆素抗体ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种敏感性高、特异性强的抗苦马豆素(Swainsonine,SW)抗体的ELISA检测方法。【方法】用SW人工抗原(SW-BSA)免疫小鼠,制备抗SW血清,通过ELISA法进行血清抗SW抗体效价检测,比较以SW-OVA或SW为包被抗原的检测结果,分析包被抗原浓度、封闭剂等对测定结果的影响,以确定测定的最佳条件。【结果】以SW-OVA为包被抗原的检测结果明显优于以SW为包被抗原;抗苦马豆素抗体的最佳测定条件为:以1.0μg/mL SW-OVA作为包被抗原,于4℃包被过夜或37℃包被2 h,选用15 g/L的明胶作为封闭剂,酶标抗体的工作浓度为1∶1 500。【结论】建立的抗苦马豆素抗体ELISA检测方法,特异性强、稳定性高,为进一步研究苦马豆素人工抗原的免疫原性等奠定了基础。     

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物（CTN-OH）;采用N, N-羰基二咪唑法（CDI）将CTN-OH与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV 和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng•mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103 、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng•mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng.mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng.mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

巴氯芬人工抗原的合成及其鼠源多克隆抗体的制备

【目的】合成巴氯芬（baclofen,BA）人工抗原并制备其多克隆抗体,为巴氯芬免疫学快速检测方法的建立奠定基础。【方法】采用碳二亚胺（EDC）法将BA分别与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）偶联,合成免疫抗原BA-BSA和包被抗原BA-OVA,通过紫外扫描和SDS PAGE凝胶电泳鉴定其偶联效果。将免疫抗原BA-BSA免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA、间接竞争ELISA及交叉反应试验分别对所获多克隆抗体的效价、敏感性、特异性等免疫学特性进行鉴定。【结果】紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳结果表明人工抗原偶联效果良好。ELISA结果表明,多克隆抗体的效价达到1∶256 00,半数抑制浓度（IC₅₀）为22.33 ng/mL,且与巴氯芬结构类似物及其他瘦肉精类药物（γ-氨基丁酸、氯丙那林、可乐定、赛庚啶、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺）交叉反应率均小于0.3%,具有良好的敏感性和特异性。【结论】成功合成了巴氯芬人工抗原,并制备了免疫学特性良好的巴氯芬鼠源多克隆抗体。     

赤霉毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)酶联免疫检测方法研究

【目的】建立快速、灵敏、有效的毒素检测方法，以保证麦类作物的安全生产以及谷物食品的安全性。【方法】以主要赤霉病菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)为对象，利用半琥珀酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇的牛血清蛋白偶联物（3-HS-DON-BSA）作免疫原，分别采用腹膜腔注射法和颈、背部多点注射法免疫Balb/c小鼠和豚鼠，获得DON 的多抗血清，建立间接ELISA检测方法。【结果】多抗豚鼠血清的效价达到1∶6 400，而小鼠混合血清的效价则为1∶12 800。引起DON抗体最大结合50%抑制时，所需DON及其类似物3-Ac-DON和T-2毒素的量分别为 63μg•ml-1、114μg•ml-1和＞1 000μg•ml-1；相对交叉反应率分别为 100%，55.2%和6.3%。包被抗原的最适工作浓度为1/1 500，小鼠血清工作浓度为1/1 600。在包被原和小鼠血清的最适工作浓度下，20%以上的甲醇稀释度对DON免疫分析有显著的影响，低于10%浓度的甲醇对DON免疫分析基本无影响。建立的间接竞争ELISA法检测范围为0.01～100μg•ml-1，检出限为0.02μg•ml-1，平均回收率为82%～93%，精密度(CV%)为4.65%～21.3%。【结论】本文提出的毒素检测方法，检测成本低,方便易行,不仅可以应用于小麦赤霉病的病理学研究，也可广泛应用于谷物及其制成品中DON毒素的含量检测，具有较好的应用价值。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br#

 【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

四环素类药物多残留酶联免疫检测方法

 【目的】构建一种四环素类药物多残留酶联免疫检测试剂盒。【方法】将四环素类药物与载体蛋白相连作为抗原免疫动物,获得了抗四环素类药物的抗体,建立了动物性食品中四环素类药物残留的ELISA检测方法,并将该试剂盒的检测性能与进口试剂盒比较,对实际样品的测定结果与高效液相-串联质谱法比较。【结果】人工抗原中四环素与蛋白质分子的结合比约为15﹕1,血清效价达到1﹕2 000倍以上,50%抑制浓度(IC50)为3 μg?L-1左右,7种四环素类药物交叉反应率在58%～100%之间,牛奶和鸡肉中四环素类药物的检测限分别为6.6 μg?L-1和6.5 μg?kg-1, 在鸡肉中四环素、土霉素和金霉素的回收率在40%～120%之间。【结论】试剂盒的最低检测限为0.3 μg?L-1,检测范围为0.3～30 μg?L-1,可同时测定兽医常用的四环素、金霉素、土霉素和多西环素4种药物残留。灵敏度、精密度和准确度均能满足兽药残留检测要求。     

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6-7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1;抗体工作浓度：1﹕6400;二抗稀释度：1﹕1000;底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1,标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956）,与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%-87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%-10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%-88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%-10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%-6.68% ,批间变异系数在4.69%-9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%-110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。     

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立

 【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌（Haemophilus Parasuis,HPS）外膜蛋白P5（outer-membrane protein P5,OMP5）,建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体 pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化,最终建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的HPS OMP5蛋白做抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为 1:400,血清的最佳稀释度为1:160。用建立的间接ELISA 方法检测317份未进行HPS免疫的健康猪血清,结果检出72份阳性,检出率为22.71%,与广东地区发病猪中的HPS分离率24%接近。同时,用该方法与用超声破碎抗原建立的ELISA方法同时检测了78份血清样品,结果,该法检出27份阳性,检出率为34.62%,后者则检出31份阳性,检出率为39.74%,二者符合率为71.79%。【结论】本研究利用重组表达的OMP5蛋白作为抗原建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 方法,特异性好、重复性好,检出率与HPS临床分离率接近,可用于副猪嗜血杆菌的临床检测、流行病学调查和免疫监控。     

H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立

 【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1﹕64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1﹕1 024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1﹕32以上,三免后2周HI抗体平均效价达到1﹕512,说明其有良好的免疫原性。【结论】H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;重组细胞高产型猪流感病毒株的拯救为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。     

牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的与方法]以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-Tams1抗原的最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释倍数为80倍,ELISA阳性反应的临界值为OD<,450>≥0.282,批内和批间重复试验的变异系数均小于15;.Tams1间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与环形泰勒虫病巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]建立的Tams1间接ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法,为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

抗氯霉素单克隆抗体的制备及直接竞争ELISA方法的建立

用人工合成的氯霉素-卵清蛋白(CAP-OVA)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选出1株能稳定传代并分泌抗氯霉素(CAP)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞4C9,并以此制备腹水单抗.经间接竞争ELISA(ciELISA)检测,该单抗亚类重链类型是IgG1,轻链为κ类型,单抗腹水效价为1∶1×106,与甲砜霉素、氟甲砜霉素以及其他常见抗生素的交叉反应率小于0.01%.用过碘酸钠氧化法合成CAP酶标记单抗,建立了CAP直接竞争ELISA(cdELISA)方法.此法检测的线性范围为0.1~100 ng·mL-1,半数抑制浓度(IC50)为5.81 ng?L-1.添加回收实验表明所建立的CAP cdELISA方法检测限达到0.1 ng·L-1,对比试验表明其检测灵敏度与商品试剂CAP ELISA基本相当.     

氟喹诺酮类药物多残留酶联免疫检测方法的建立

【目的】氟喹诺酮类药物（FQs）在畜牧业中广泛用于预防和治疗细菌性疾病,不合理使用导致在动物性食品中残留,严重危害消费者健康,其检测受到世界各国重视。制备抗多种FQs单克隆抗体（mAbs）,建立间接竞争ELISA（icELISA）检测方法,为动物性食品中FQs多残留检测奠定基础。【方法】环丙沙星（CPFX）羧基上引入氨基丁酸后为半抗原（CPFX-A）,质谱鉴定;分别用碳二亚胺法（DDC）和混合酸干法将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成免疫原（CPFX-A-BSA）和包被原（CPFX-A-OVA）,紫外和红外光谱鉴定是否偶联成功;CPFX-A-BSA 免疫Balb/c小鼠,间接ELISA和icELISA方法测定多抗血清效价和敏感性,选取抗血清效价高和敏感性好的鼠用于细胞融合;NS0细胞和脾细胞按1﹕5比例在PEG-1500作用下融合,筛选抗FQs杂交瘤细胞株,并进行效价、亚型、敏感性和交叉反应率鉴定;体内诱生腹水法制备mAb,液体石蜡作为诱导剂,每只鼠注射10⁸个杂交瘤细胞;选敏感性和广谱特异性好的腹水mAb,建立icELISA标准曲线,对icELISA检测方法优化,在鸡肉中添加10种FQs进行测定,将测定结果与HPLC法比较,用SPSS 17.0软件进行显著差异性分析。【结果】半抗原改造和人工抗原合成成功;3只鼠血清效价均达到1﹕1.28×10⁴以上,2号鼠血清效价最高（1﹕2.56×10⁴）,且IC₅₀值最低（12.92 ng·mL^-1）,选择2号鼠作为细胞融合用鼠;4次亚克隆筛选并鉴定后获得3株敏感广谱特异的杂交瘤细胞,分别命名为2H5、3D11、4F4,细胞上清效价分别为1﹕1 600、1﹕1 600和1﹕800,腹水效价分别为1﹕1.6×10⁶、1﹕8.2×10⁵和1﹕8.2×10⁵;icELISA方法的包被原浓度为1 μg·mL^-1,5%猪阴性血清4℃包被过夜,单抗1﹕40 000稀释,山羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP） 1﹕8 000稀释;反应温度均为37℃,标准品与单抗同时加入反应15 min,洗板后加二抗反应25 min;显色10 min,2H5细胞株腹水敏感性和广谱特异性最好,2H5的线性回归方程为y=-28.022x+56.219,R²=0.9 782,对10种FQs的IC₅₀值分别为环丙沙星（CPFX）1.67 ng·mL^-1、诺氟沙星（NOR）1.82 ng·mL^-1、培氟沙星（PEF）1.97 ng·mL^-1、恩诺沙星（ENR）1.54 ng·mL^-1、单诺沙星（DAN）2.79 ng·mL^-1、洛美沙星（LOM）3.38 ng·mL^-1、氧氟沙星（OFL）5.50 ng·mL^-1、麻保沙星（MAR）4.40 ng·mL^-1、沙拉沙星（SAR）11.76 ng·mL^-1、二氟沙星（DIF）13.60 ng·mL^-1,与10种FQs的交叉反应率为12.3%-108.4%,与非FQs交叉反应率均低于0.01%,对10种FQs的检测限（LODs）为0.09 ng·mL^-1-0.64 ng·mL^-1。icELISA法鸡肉中10种FQs的回收率为80.5%-91.8%,HPLC法的回收率为85.1%-95.7%,二者变异系数均低于10.0%;两种检测方法差异不显著（P＞0.05）。【结论】该试验获得了高效价、敏感、广谱特异性的mAbs,建立的icELISA方法可用于同时检测鸡肉中10种FQs。