水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

 通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体。突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应。携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当。免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外。这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性。     

白叶枯病菌xopXoo基因在致病性中的作用

辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv)在非寄主烟草上的过敏反应与xopX基因有关,但在白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)基因组中并未标注xopX同源基因的功能。为研究白叶枯病菌中xopX同源基因在致病性中的作用,对白叶枯病菌的xopXoo基因进行了克隆和突变,并对xopXoo突变体在非寄主烟草上的过敏反应、水稻苗期的水浸症状以及成株期的致病性和病菌生长能力进行了分析。测定结果显示,xopXoo基因突变并不改变白叶枯病菌在烟草上激发过敏反应和在水稻上产生水浸症状能力,但突变菌株在成株期水稻上的致病性和菌体生长能力显著下降。遗传互补能够恢复xopXoo突变体的致病性和菌体生长能力,表明xopXoo是白叶枯病菌的致病性基因。还对白叶枯病菌激发非寄主烟草产生过敏反应的可能基因进行了讨论。     

中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株无毒基因的分离及功能鉴别

 白叶枯病菌与水稻间的互作符合基因对基因模式,不同小种中存在特异的avrBs3/pthA家族基因。对中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株基因组DNA进行BamHⅠ酶切和Southern杂交,发现了其特有的约6.0 kb大小、含avrBs3/pthA家族基因的信号条带。经文库筛选、Southern杂交和限制性酶切分析,获得了C8小种avr/pthC8a基因。将该基因导入菲律宾小种6 的代表菌株PXO99A中,发现avr/pthC8a可使PXO99A丧失对水稻品种Asominori（携有成株期抗性基因Xa17）的毒性,暗示avr/pthC8a可能是与Xa17相应的无毒基因。序列分析发现,avr/pthC8a基因大小为3816 bp,编码1272个氨基酸,由102 bp编码的34个氨基酸重复单元在基因内的重复数为20.5个,其3′端的BamHⅠ酶切位点由GGATCC突变为AGATCC,其他特征均与avrBs3/pthA家族的成员相似,即C端存在1个亮氨酸拉链、3个核定位信号和1个酸性转录激活域。avr/pthC8a基因3′端的BamHⅠ酶切位点发生突变在avrBs3/pthA家族基因中鲜有报道。中国C8小种avr/pthC8a基因的发掘,为进一步了解水稻黄单胞菌毒性变异以及avrBs3/pthA家族基因的进化提供了理论依据。     

hrcQ基因决定水稻条斑病菌在非寄主烟草上的过敏性反应和在寄主水稻上的致病性

 水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）hrcQ 基因在动植物病原细菌中高度保守。不同植物病原细菌的HrcQ蛋白因在N端有变化,推测可能与分泌的效应分子特异性有关。但水稻条斑病菌HrcQ蛋白对Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system, T3SS)的形成以及对效应分子的分泌性影响还不清楚。为弄清HrcQ蛋白在此方面的作用,利用同源重组方式获得了水稻条斑病菌^hrcQ基因的敲除突变体,该突变体丧失了在烟草上激发过敏性反应的能力和在水稻上的致病性。hrcQ基因与水稻细胞互作时受诱导表达。蛋白质 蛋白质互作结果显示,HrcQ可分别与Hpa1、HrcN、HrpB5和HrpB2互作。分泌性检测发现,HrcQ不通过T3SS分泌至胞外。hrcQ基因突变,影响Hpa1和HrpB2蛋白分泌。这些结果表明,HrcQ蛋白是形成Ⅲ型分泌系统的基本组分,并通过帮助Hpa1和HrpB2等T3SS效应因子的分泌,从而影响病菌在非寄主上的过敏性反应和在水稻上的致病性。这为进一步分析水稻黄单胞菌T3SS的形成和分泌机制奠定了基础。     

白叶枯病菌拮抗菌筛选及水稻叶围微生物互作研究初报

 1998年7月～10月, 于田间汕优63水稻叶片上分离采集微生物, 并进行叶围微生物鉴定,以筛选白叶枯病拮抗菌。结果表明:除极少量分布的真菌和细菌外, 主要种群包括真菌类群Alternaria和 Fusarium属; 细菌类群Flavobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas和Bacillus属。对白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）具有明显拮抗作用的微生物为Bacillus属,而且Bacillus属细菌对其余大部分叶围微生物具有程度不同的拮抗作用,可以初步断定其产生的拮抗物质具有一定的广谱性。     

白叶枯病菌效应子XopN在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用

【目的】黄单胞菌细胞外泌蛋白质(Xanthomonas outer proteins, Xops)是植物病原黄单胞菌高度保守的毒性效应子或毒性辅助组分,通过细菌Ⅲ型分泌系统分泌到细菌细胞外部,然后转入植物细胞而发挥病理作用。水稻黄单胞菌水稻致病变种即水稻白叶枯病菌的标准菌株PXO99^A分泌的XopN是一种毒性效应子,通过影响寄主免疫反应而使水稻发病。但是,XopN对病菌毒性的影响是否因水稻品种的不同而异,还有待研究。【方法】利用同源双交换技术,先敲除了PXO99^A的XopN基因,获得了∆XopN突变体,又经过遗传互补,得到了回补菌株∆XopN/XopN。通过营养肉汤液体培养,测定了XopN对病菌繁殖能力的影响;根据文献选用14个水稻品种,通过接种实验,测定了PXO99^A对这些品种的毒性与XopN敲除或回补的影响;在XopN发挥毒性作用的水稻品种上,测定了隐性抗病基因OsSWEET11/xa13与显性感病基因OsSWEET11/Xa13受病菌侵染而表达的情况,分析了XopN敲除或回补的影响。【结果】在营养肉汤液体培养过程中,病菌突变体菌株∆XopN的繁殖速度明显低于野生型PXO99^A。PXO99^A、∆XopN和∆XopN/XopN接种水稻后,根据其在水稻叶片组织内的繁殖量及随后产生的白叶枯病症状的严重程度,将供试的14个水稻品种分为两种情况。一是感病程度与病菌XopN是否敲除或回补无关,这有10个水稻品种（IRBB1、IRBB3、IRBB8、IRBB10、IRBB14、IR24、IRBB203、IRBB204、IRBB205和IRBB211）,PXO99^A、∆XopN和∆XopN/XopN对它们的毒性无明显差别。二是XopN对病菌毒性发挥作用的水稻品种,包括高度感病的3个品种（IRBB208、Asominori和日本晴）和低感品种IRBB13。与PXO99^A或∆XopN/XopN相比,∆XopN对这4个水稻品种的毒性大为降低。在IRBB13上,病菌侵染对隐性抗病基因OsSWEET11/xa13在叶片内的表达发生抑制作用,这一效应与XopN的毒性功能相关。相反,日本晴显性感病基因OsSWEET11/Xa13却受病菌侵染的诱导,在叶片内的表达水平大幅度提高。IRBB208和Asominori携带OsSWEET11/Xa13同源基因,该同源基因在叶片内的表达水平也因病菌侵染而大幅提高。在这4个水稻品种上,PXO99^A和∆XopN/XopN能够诱导OsSWEET11/Xa13或其同源基因表达,但∆XopN无此作用。另外,XopN对病菌在非寄主植物烟草上诱发过敏反应有量变贡献,相比PXO99^A或∆XopN/XopN,∆XopN引起过敏反应的程度有所降低。【结论】XopN是一个有限广谱性效应子,在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用。XopN也是病菌繁殖所需要的,对病菌在非寄主植物上诱导过敏反应有一定贡献。     

云南高海拔粳稻区白叶枯病菌致病力差异分析

云南高海拔粳稻区白叶枯病危害日益严重,为了探明该区域白叶枯病菌致病力差异,对白叶枯病进行有效防控。利用15个水稻白叶枯病菌鉴别品种,对采集自海拔1800 m以上稻区11个水稻品种上的32份菌株进行致病力研究。结果发现,致病力最强的菌株是楚雄州的CX28-3和CX30-1,致病率为73.33%;最弱的是大理州剑川县的JC12-2,致病率为0。在高海拔粳稻区,菌株的致病力分化与采集地的海拔高度无关,却与地理距离、采集品种的推广面积有关;而菌株的致病型频率与其采集地的海拔、经纬度、采集品种的推广面积的相关性均不显著。鉴别品种毫糯扬(含新基因)、IRBB14(Xa14)、IRBB4(Xa4)和Tetep(Xa2,Xa16)对所有参试菌株表现为高抗或抗。因此,这些品种内所含的抗性基因值得在云南高原粳稻育种和生产中应用,特别是云南地方稻种毫糯扬,更应加强其新抗病基因的定位和克隆,以为品种选育提供新的抗原。     

云南滇西北高原粳稻区白叶枯病菌致病型鉴定及分布

 用7个高原粳稻白叶枯病菌鉴别品种（毫糯扬、TN1、黄玉、珍珠矮、IR26、南粳33、金南风）对2008年采自云南滇西北高原粳稻区楚雄州、大理州、丽江市的30个白叶枯病样本分离菌株进行致病型鉴定,并分析其分布。结果表明,供试的30个菌株可分为9种致病型,Ⅰ型为优势群,Ⅴ型为毒性群。菌株DL08 19在上述7个鉴别品种上的病情反应模式为RRRRSSS（R为抗, S为感）,有别于曾报道过的所有菌株致病型,故推断它为一个新型菌株。     

中国水稻白叶枯病菌群体结构的初步分析

 用两个DNA探针pJEL101和pBSavrxa10，测定了78个来自18个地区的水稻白叶枯病菌系的RFLP型，其中主要来自华北、东北和少数来自华中、华南，以分析其群体结构和遗传多样性。各菌系的基因组DNA分别用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切探针pJEL101或pBSavrxa10。通过分子杂交，分别鉴定出16种RFLP型。病原型1、2和6的多数来自华北和东北菌系表现14种RFLP型。它们之间多数只有一带之差，或有3～4个带位不同。然而，它们与来自广东和云南的菌系相比，差别较大，有7～8条带位不同。根据参试菌系的RFLP带型分簇（Cluster），如以彼此之间的带位相似率达85%为界，可分为6簇，多数病原型1、2和6的菌系为簇1，少数几个菌系，LN43、GD1358和YN5分别为簇4、5和6。参试的菌系群体遗传变异为0.77（pJEL101）和0.83（pBSavrxa10）。也分析了亚群体的各病原型内的遗传变异，初步分析表明中国的水稻白叶枯病菌系的遗传变异多种多样。但尚需测试更多的来自华南；华中和西南地区的菌系，方能较系统地分析全国菌系的群体结构及其遗传关系。     

水稻珍汕97不育胞质与白叶枯病菌早期互作中的活性氧反应

 测定了珍汕97不育胞质和正常胞质的稻苗与白叶枯病菌在早期的互作反应,结果表明,互作体系刚建立时,稻叶内立即产生大量的超氧阴离子(O₂^-),从而激发超氧物歧化酶(SOD)和脂肪氧合酶(LOX)活性的增高,导致脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量的提高。当特异性菌株Ah28接种在不育系材料(亲和组合)上,上述反应的变化幅度和产生量均小于与正常胞质的组合(非亲和组合),非专化性菌株Os14对活性氧代谢的诱导作用在两种胞质之间差异不明显。这说明不育胞质对白叶枯病较低的抗性和专化性菌株的特异致病性均与较低的活性氧代谢水平有关。     

水稻抗病基因介导的抗白叶枯病反应中蛋白质表达谱的比较分析

采用双向电泳 质谱分析技术,比较分析了水稻在接种白叶枯病菌 （Xanthomonas oryzae pv. oryzae）1、4、8、24、72 h 后蛋白质表达谱的差异。通过比较接种白叶枯病菌和对照之间、接种不同白叶枯病菌生理小种之间的表达差异,鉴定了72个差异表达的抗病相关蛋白点,对其中部分点的蛋白质进行了电离子喷雾二级质谱学分析鉴定,确定了11个抗病反应中差异表达的蛋白质。     

OsDUF500基因沉默提高水稻对白叶枯病的抗性

 以编码HarpinXoo 的hrf1转基因水稻NJH12的cDNA为模板,克隆到了DUF500的保守功能区。序列分析表明,OsDUF500是DUF500家族成员,功能未知。构建OsDUF500的沉默载体,用土壤根癌农杆菌介导的方法转化粳稻 R109,用Hpt抗生素做抗性筛选,获得9个再生株系。经分子鉴定,8个为沉默株系（ABD 2~9）。与野生型相比, ABD株系株高变矮,叶片变短,出现白色空秕谷。白叶枯病抗性鉴定结果表明,OsDUF500沉默株系对水稻白叶枯病的抗性存在差异,病斑长度比野生型明显缩短,病斑面积均在30%以下,株系ABD 3和ABD 5病斑面积分别为12.3%和15.7%,显示出较好的抗性。推测在稻瘟病抗性中上调表达基因OsDUF500对水稻白叶枯病抗性起负调控作用。     

云南高原粳稻区白叶枯病菌的致病型初步鉴定

利用采自云南高原粳稻区病叶分离的17份水稻白叶枯病菌株,在30份水稻品种上接种进行致病型初步鉴定。研究表明可以将17个菌株分为7个致病型（Ⅰ~Ⅶ）,其中Ⅴ型菌为云南高原粳稻区的优势菌群。初步构建了一套包含7个品种（黄玉、毫糯扬、TN1、珍珠矮、IR26、南粳33、金南风）的高原粳稻白叶枯病菌的鉴别品种,明确了7个致病型在这套鉴别品种上的反应型。早生爱国3号(Xa-3)、IR1545-339(xa-5)、IRBB21（Xa-21）、扎昌龙（Xa-22t,Xa-24t）对所接种菌均表现抗病,在云南高原粳稻育种中具有较好的利用前景。     

苯并噻二唑诱发水稻对白叶枯病的系统获得抗性

用苯并噻二唑（benzothiadiazole, BTH)(0.5 mmol/L）、水杨酸（1 mmol/L）、硝酸镍(0.5 mmol/L)、多效唑（300 mg/L）和烯效唑（40 mg/L）处理4叶1心期稻苗后接种白叶枯病菌,病斑长度明显降低。BTH对白叶枯病病菌生长无明显抑制作用。BTH诱发稻苗对白叶枯病抗性的最佳浓度为0.5~1 mmol/L;在诱发处理和接种之间至少需要2 d才能诱导抗性,间隔7 d的诱导抗性效果最好,诱导抗性的持久期至少15 d。BTH处理稻苗第2叶,可使未处理的第3和第4叶上也表现出诱导抗性,但处理后至少需要24~36 h上部叶片才表现出诱导抗性。结果表明,BTH诱导对白叶枯病的抗性是一种系统获得抗性反应。     

我国长江以南地区水稻白叶枯病原菌遗传多样性分析

用IS-PCR和rep-PCR法结合传统病理学分析了128个主要采自我国华中、华南和西南地区的水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的群体遗传多样性。用4个专化引物J3、ERIC、REP和BOX对114个菌系基因组DNA进行PCR扩增反应,4个引物分别呈现20、12、6和5种谱型,遗传多样性值分别为0.82、0.49、0.35和0.30。以彼此间带位相似率达70%为界,用UPGMA聚类分析法,可将114个病原菌分为6簇（J3）和5簇（ERIC）。引物J3的簇1中包括0~Ⅴ、Ⅶ 7个病原型,ERIC引物的簇1中包括0~Ⅶ 和新型9个病原型。将128个病原菌在我国5个鉴别品种上测定以进行病原型分群,参试菌系多数属于Ⅳ型、Ⅱ型和0型,并出现了一群系列反应型不同于所有病原型的新类型。