基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.     

一种海洋来源蜡样芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆表达及功能鉴定

为获得高效的α-半乳糖苷酶并了解其功能,采用基因工程技术,从鹿角菜中筛选获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus中克隆得到一个新的α-半乳糖苷酶基因(BcgalA),并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功进行了重组表达.结果表明:BcgalA基因序列编码441个氨基酸,预测的BcGalA...     

报告基因在柞蚕幼虫体内表达的研究

利用柞蚕核型多角体病毒 (Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus, ApNPV)作为载体研究了报告基因 (β-半乳糖苷酶基因 )在柞蚕幼虫体内的表达.结果表明重组 ApNPV能够使柞蚕幼虫产生典型的脓病病症,但不形成多角体.柞蚕核型多角体病毒作为表达载体能够使β-半乳糖苷酶基因在柞蚕幼虫体内得到高效表达.雌性幼虫个体的表达量为 2.4× 107u,雄性幼虫个体的表达量为 1.8× 107U;雌性个体较雄性个体在表达时相上早 96h;对于同一个体,组织细胞中β-半乳糖苷酶的含量较血淋巴上清液中β-半乳糖苷酶的含量高. SDS- PAGE结果显示 ,所表达的β-半乳糖苷酶分子量为 116kD.     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

蜡梅α-半乳糖苷酶基因的克隆和表达分析

从蜡梅中克隆α-半乳糖苷酶基因,通过对其酶学性质及基因表达分析,为研究蜡梅的低温适应的分子机理提供参考.通过PCR扩增获得α-半乳糖苷酶基金(CpGAL),构建了该基因的原核表达载体pET28a-CpGAL并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达并分离纯化得到融合蛋白.利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测CpGAL基因在腊梅不同发育时期的表达差异.     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

利用柞蚕幼虫繁殖rApNPV的研究初报

利用重组柞蚕核型多角体病毒(RecombinantAntheraeapernyiNuclearPolyhedrosisVirus,rApNPV) ,研究了无包涵体重组病毒(含β-半乳糖苷酶基因)在柞蚕幼虫体内的繁殖情况。结果表明 :无包涵体的重组病毒能够在柞蚕幼虫体内正常繁殖并引起继发感染 ,经柞蚕幼虫繁殖的重组病毒粒子能够完成对柞蚕幼虫的再次创伤感染。重组病毒所携带的β-半乳糖苷酶基因经柞蚕幼虫繁殖后仍能在柞蚕幼虫体内获得高效表达 ,表达量达到经培养细胞繁殖的重组病毒在柞蚕幼虫体内的表达水平 ,说明在利用杆状病毒批量表达外源蛋白时 ,可采用昆虫幼虫体内繁殖方法繁殖重组病毒     

集胞藻PCC6803染色体上relNEs(ssr1114/slr0664)TA系统的反馈调控作用

细菌染色体上的毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性,从而控制细胞的生长速度和死亡,使细菌适应各种环境胁迫。为了证明集胞藻PCC 6803染色体上relNEs TA系统的转录调控,构建了以无启动子的β-半乳糖苷酶(lacZ)基因为报告基因的重组质粒,并测定含转录融合重组质粒的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果表明,抗毒素RelN能显著抑制relNEs启动子的转录活性,而毒素RelEs能部分减弱这种抑制作用,提示relNEs系统的编码产物对该操纵子具有反馈调控作用。     

α-半乳糖苷酶及其在肉鸡日粮中的应用

[目的]综述α-半乳糖苷酶及其在肉鸡日粮中的应用。[方法]对α-半乳糖苷的结构、特性、抗营养作用机理及α-半乳糖苷酶的特性及在肉鸡日粮中的应用进行综述,并展望了其应用前景。[结果]α-半乳糖苷是无色透明状液体,甜度为蔗糖的70%,总能为8 136kJ/g,粘度低于麦芽糖,吸湿性比蔗糖小。α-半乳糖苷由半乳糖、葡萄糖和果糖组成,具有良好的热稳定性。在肉鸡日粮中添加α-半乳糖苷酶后,肉鸡日增重增加,能量代谢及养分利用率提高。[结论]该研究为进一步推进该酶制剂在肉鸡日粮中的合理应用奠定基础。     

真核表达质粒pIRES-ST3GAL Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的初步表达

构建β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GALI)基因的真核表达载体p IRES-ST3GALI,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达。以p GEM-ST3GALI质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增ST3GAL I基因,通过酶切和连接,构建真核表达载体p IRESST3GALI。经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化筛选阳性重组大肠杆菌(DH5α),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,并用12%SDS-PAGE鉴定。结果表明,重组质粒p IRES-ST3GAL I中的ST3GAL I序列与原鸡的ST3GAL I氨基酸序列同源性98.8%,与猪的同源性达53.5%,与人的同源性达52.6%。β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I在大肠杆菌中实现了良好的表达。本试验已成功构建了含有β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)的真核表达载体p IRES-ST3GAL I,为其转染传代细胞建立重组传代细胞系奠定了基础。     

猪α-干扰素的原核表达

重组质粒pMDIFN-α中的猪α-干扰素基因经双酶切,亚克隆到原核表达载体pET-．28a,构建了重组表达质粒pETIFN-α,经过SDS-PAGE蛋白质电泳,测得表达蛋白的相对分子质量约为26500．表达蛋白的Western-blotting分析显示：改进后的半干胶转印免疫印迹法灵敏度高、特异性强、重复性好;获得的重组融合蛋白具有良好的反应原性．     

黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ的亚细胞定位

基因枪法将经测序验证的黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ基因--EGFP融合表达载体导入洋葱表皮和黄瓜愈伤组织细胞,共聚焦显微镜下观察EGFP的表达情况.结果表明,该基因在包括液泡在内的整个细胞中均有表达.     

稻瘟菌蛋白激发子在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1,并在其上下游分别引入酶切位点EcoRI和XhoI,经双酶切后与诱饵质粒载体pLexA连接构建重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,将该重组诱饵质粒转入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中进行β-半乳糖苷酶整板分析检测自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为筛选番茄cDNA文库获得诱饵蛋白PemG1的相互作用蛋白奠定了基础。     

从发芽咖啡豆中分离纯化α-半乳糖苷酶的研究

[目的]研究从发芽咖啡豆中分离纯化α-半乳糖苷酶。[方法]通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephacry1 S-200-HR凝胶过滤色谱等分离纯化技术,从发芽咖啡豆中分离纯化a-半乳糖苷酶。SDS-PAGE用来分析该酶的纯度和分子量。[结果]经过3步分离纯化之后,发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活达到191.50 nkat/mg,纯化倍数为23.18倍。与绿咖啡豆α-半乳糖苷酶相比,发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活较高,但产率和总的提取率都较低。SDS-PAGE分析结果表明,该酶出现单一谱带,分子量为3 8805 D。[结论]发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶产量和总提取率的提高有待进一步的研究。     

培养基组分对水稻源Globotriose合成酶异源表达的影响

Globotriose是一种具有重要生理功能的α-低聚半乳糖,难以从天然产物中直接提取,酶法合成是主要的制备方式.水稻源GH36族α-半乳糖苷酶具有一步合成Globotriose的能力,但该酶在重组大肠杆菌中表达量和酶活力较低.为进一步提高酶蛋白的表达,以酶活力、菌体质量以及总酶活力为指标,研究LB、SOB、SOC、S...     

酵母菌生长曲线的测定及其转葡萄芪合酶基因重组菌遗传稳定性的检测

采用分光光度计比浊法测定酿酒酵母INVSc1的生长曲线,确定菌体生长规律;并以此为依据,制备酿酒酵母感受态细胞,进行葡萄芪合酶基因酿酒酵母重组质粒的转化;采用菌落PCR法快速鉴定阳性重组子,并进一步检测重组质粒在重组菌中的稳定性.结果表明,于酵母菌对数生长中期(OD600为0.8时)进行重组质粒的转化,可以得到较高的转化效率;在0～72 h发酵培养过程中重组质粒在宿主菌中的稳定性达到100%.这为后续工作开展葡萄芪合酶基因在酿酒酵母中的诱导表达研究奠定了技术基础.     

猪IFN-α基因在干酪乳酸杆菌中的表达及反应活性鉴定

【目的】构建能够稳定表达猪α-干扰素(IFN-α)成熟蛋白的重组干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei CECT5276),为将其作为口服疫苗来提高动物机体免疫力奠定基础。【方法】从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪IFN-α成熟蛋白基因,再将其定向克隆到干酪乳酸杆菌整合型表达载体pMJ67的lac启动子下游,得到重组质粒pMJ67-IFN-α,电穿孔转化干酪乳酸杆菌。抽提干酪乳酸杆菌基因组DNA,进行PCR扩增及测序鉴定。采用半定量RTPCR检测猪IFN-αmRNA在干酪乳酸杆菌中的转录水平;采用Western blot对重组干酪乳酸杆菌菌体进行分析,检测其表达产物的活性;用双抗体夹心ELISA法确定最适的乳糖诱导质量浓度。【结果】PCR扩增获得了501bp的IFN-α,成功构建了重组质粒pMJ67-IFN-α,转化干酪乳酸杆菌后获得了重组乳酸杆菌。半定量RT-PCR结果显示,IFN-αmRNA在诱导16h时表达水平最高;Western blot分析表明,构建的重组干酪乳酸杆菌成功表达出了相对分子质量约19ku的重组蛋白,其可与鼠抗猪IFN-α抗体发生特异性反应。ELISA结果表明,当乳糖诱导质量浓度达到8g/L时,猪IFN-α成熟蛋白的表达量达到最大,为1.3μg/L。【结论】将猪IFN-α成熟蛋白基因整合到干酪乳酸杆菌基因组中,构建的重组乳酸杆菌能够稳定表达猪IFN-α成熟蛋白。     

葡萄芪合酶基因cDNA片段酵母表达载体的构建及其在酿酒酵母中的表达

应用基因重组技术,将从华东葡萄白河-35-1中分离出的长1179 bp芪合酶(stilbene synthase,STS)基因的cDNA片段克隆入大肠杆菌-酵母菌穿梭型诱导表达载体pYES6/CT上,构建重组酵母真核表达质粒pYES6/CT-STS,转化酿酒酵母菌株INVSc1,用Blasticidin(bsd)筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行5个时间段菌体全蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果发现,诱导4 h后开始有目标带(48 ku)出现,诱导16 h开始大量且稳定表达。证明目的基因片段可以在酿酒酵母中表达,为后续基因功能的验证奠定了基础。