烟草环斑病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法研究

根据TRSV CP基因的保守序列设计引物,RT-PCR和IC-RT-PCR能从TRSV的2个分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带,序列测定和分析表明所扩增序列为TRSV CP基因的部分序列,在系统关系树上与TRSV的其他分离物形成一簇,表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。     

RT-PCR方法检测烟草环斑病毒的研究

 根据烟草环斑病毒（TRSV）外壳蛋白基因非编序列设计的引物P1,P2,用感病及健康组织总RNA为模板,进行cDNA 合成和PCR试验,感病组织中扩增出了600 bp的目的片段,而健康组织中无此扩增带。摸索各项实验条件,建立了RT-PCR检测烟草环斑病毒（TRSV）的方法。     

齿兰环斑病毒外壳蛋白的原核表达、抗体制备及检测应用

齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)是感染兰花的主要病毒之一.用RT-PCR方法从感染ORSV兰花中克隆到该病毒的477 bp外壳蛋白基因(CP),外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建重组原核表达载体pET-32a-CP;将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为37 ku含硫氧还蛋白的融合蛋白.以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备ORSV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多抗建立了可靠、灵敏、特异的检测ORSV的免疫捕获RT-PCR及dot-blot ELISA方法,为该兰花病毒病的诊断、兰花抗病育种和脱毒苗的建立打下了基础.     

番木瓜环斑病毒CP基因dsRNA原核表达载体的快速构建

重点介绍了一种快速构建dsRNA原核表达载体的方法。以番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRSV-CP）3＇端-279 bp保守区段为基础,通过OZ-LIC法构建861 bp,432 bp和279 bp 3种不同长度的发卡结构,再通过XhoⅠ和ClaⅠ双酶切,将其连接到pSP73原核表达载体上,构建成PRSV-CP基因dsR...     

基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备

基于多种生物信息学软件综合预测烟草环斑病毒(TRSV)外壳蛋白抗原表位所在的结构域,明确了该外壳蛋白抗原表位可能位于C端319～328、384～388、420～430、480～487、495～511位氨基酸残基附近。通过RT-PCR扩增出了目的片段,构建了TRSV外壳蛋白原核表达载体,表达的TRSV外壳蛋白外源融合蛋白具免疫活性。采用杂交瘤细胞技术,利用外源融合蛋白制备了单克隆抗体,制备的抗血清可与TRSV外壳蛋白基因原核表达产物发生免疫反应。检验结果表明,制备的抗血清具较好的特异性,可应用于TRSV的检疫检验。     

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。     

李属坏死环斑病毒扬州分离物CP基因的原核表达及抗血清制备

李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CP^PNRSV,转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64 000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。     

烟草环斑病毒RT-PCR检测体系的优化

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的代表种,是我国公布的二类进境检疫有害生物.建立特异性强、灵敏性高的检测体系是有效控制TRSV传播的技术保障.本研究在分析引物的特异性、优化退火温度及dNTPs、引物、...     

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

番木瓜环斑病毒（PRV）外壳蛋白（CP）基因cDNA克隆到pUC18上构型建成大肠杆菌（Escherichia coli)表达载体，Western blot检测结果表明该表达载体在E.clidDH5α中有两种特异蛋白表达，分子量为34kd的蛋白与推测的表达产物大小相符，且与PRVCP的一个“组分”大小相似；而分子量为16kd的蛋白可能是34kd蛋白的降解物或者是PRV CP基因不完全表达产物。     

番木瓜环斑病毒融合基因植物表达载体的构建

利用PCR重叠延伸技术（gene splicing by overlap extension,SOE）将番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）Vb株系的外壳蛋白（coat protein,CP）基因和Ys株系的复制酶（replicase protein,RP）基因构建成融合基因VY。同时对常规的SOE法进行了改进,并对改进的SOE的反应体系进行了优化,其中以Pyrobest DNA聚合酶和60℃的退火温度为最佳。将融合基因n’构建在植物表达载体pCAMBIA2300上,测序结果表明,该融合基因的序列与设计相符。融合基因VY植物表达载体的构建,可为进一步获得对PRSV广谱抗性的转基因番木瓜奠定基础。     

烟草丛顶病毒ORF3的克隆及原核表达

利用RT-PCR方法,自烟草丛顶病毒(Tobacco bush topvirus,TBTV)龙陵分离物(TBTV-YLLi)的RNA中扩增出ORF3目的片段,并克隆到pMD18-T载体上进行序列分析.结果表明,TBTV-YLLi的ORF3全长714 bp,与TBTV其他分离物的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为98.3%~98.6%和95.4%~95.8%;与同属的花生丛簇病毒(Groundnut rosette virus,GRV)、豌豆耳突花叶病毒2号(Pea enation mosaic virus-2,PEMV-2)和胡萝卜拟斑驳病毒(Carrot mottle mimic virus,CMoMV)的核苷酸相似性分别为65.1%、61.6%和49.7%,氨基酸相似性分别为36.4%、34.6%和16.5%.将ORF3克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得的重组子pET28-ORF3转化大肠杆菌BL21-plysS,使用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG在37℃诱导培养4 h时,该融合蛋白表达量最高.融合蛋白经Ni2+亲和柱层析纯化后,SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白相对分子质量约为35 000,与预计的相对分子质量大小相一致.     

性别决定基因Sry原核表达载体的构建和蛋白检测

动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状，而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动，获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料，通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体，使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry；使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达，而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白，对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。     

一步法RT-PCR检测烟草环斑病毒试剂盒的研制与应用

根据烟草环斑病毒基因组序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术研制成一步法检测该病毒的试剂盒,并建立了操作程序。对试剂盒扩增到的预期产物进行测序验证,产物序列与目的序列间的同源性为97.8%,表明该试剂盒的准确性较高。试验结果还表明,该试剂盒在常温、4℃和-20℃下可分别保存2d、7d和60d;灵敏度是DAS-ELISA的100倍;质量控制试验结果一致,具有较高的重复性。     

李属坏死环斑病毒怀柔分离物(PNRSV-HR)外壳蛋白基因片断的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法检测了采自北京市怀柔区的樱桃叶片,将此PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上,通过转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,克隆了含有目的片段的重组质粒,并进行序列测定和分析。序列分析结果表明,认为该分离物外壳蛋白基因片断与李属坏死环斑病毒的NRSiz8株系的同源性最高,为98%,与德国分离物Ring17的同源性达99%;通过进化关系分析,认为该分离物属于引起温和症状的group,认为该分离物的第5,62,81和126位氨基酸也与CH9血清型引起温和症状的保守的替换相同。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因原核表达条件优化

    为了提高烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbCSV)复制相关蛋白(replication-associated protein, Rep)基因在大肠杆菌中表达量,研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响.结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3 h后,使用终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG在28℃诱导培养4 h时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%以上.用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66 kD,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应.Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下了基础.     

犬瘟热病毒H基因原核表达质粒的构建

为H蛋白进一步表达作为诊断用抗原、建立特异的犬瘟热病毒(CDV)抗体检测方法及CDV的预防奠定基础,以已构建含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-H质粒为模板,利用合成的特异性引物进行PCR扩增,得到1824bp的目的DNA片段,将所得H基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32...