降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性

【目的】研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）降解菌Devosia sp. DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶的酶学特性,掌握DDS-1降解3-AC-DON到3-酮基-DON特性,为该酶的开发应用奠定理论基础。【方法】LG培养基培养DON毒素降解菌Devosia sp. DDS-1后,用PBS离心洗涤菌体后采用超声波破碎,用硫酸铵沉淀菌体破碎液获得粗酶液;然后在不同的酶反应体系中检测3-AC-DON氧化酶的酶活性。【结果】降解菌DDS-1产生3-AC-DON氧化酶的最适条件为：pH 7.0、25℃、培养36 h;该酶酶反应的最适温度为35℃,最适反应pH为7.0;该酶在20—40℃,pH 5.0—9.0的范围内能保持80%以上的酶活性;大多数金属离子在浓度为0.2—2 mmol•L-1对3-AC-DON氧化酶有促进作用;乙二胺四乙酸（EDTA）对该酶活性有抑制作用;酶的定域试验结果显示该酶为胞内酶;DDS-1产生的粗酶液能很好地降解小麦中的DON、3-AC-DON毒素。【结论】Devosia sp. DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶的酶学特性研究表明,DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶具有较好的温度和酸碱稳定性,该酶反应需要金属离子作为辅因子。     

低温β-半乳糖苷酶的分离纯化

[目的]分离纯化低温β-半乳糖苷酶。[方法]采用硫酸铵沉淀、凝胶色谱和离子交换色谱对低温菌株Rahnella aquatilis sp.14-1在摇瓶条件下的所产低温β-半乳糖苷酶进行了纯化,并对提纯的酶进行了酶学性质的研究。[结果]摇瓶发酵液经过超声波破碎细胞得到粗酶液体,用硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-25凝胶层析和DEAE-cellulose离子交换色谱分离纯化得到低温β-半乳糖苷酶,用SDSPAGE检测显示电泳单一区带,纯化的酶分子量为60 kD。[结论]研究可为低温β-半乳糖苷酶的开发应用提供参考依据。     

巴尔喀什蘑菇子实体漆酶纯化与理化特性及对酚类化合物的降解能力

【目的】研究巴尔喀什蘑菇子实体的生物学特性、漆酶理化性质及对酚类化合物的降解能力,为野生巴尔喀什蘑菇的栽培驯化以及栽培料高效利用提供理论依据。【方法】利用纤维素CM-cellulose阳离子交换和Q-Sepharose阴离子交换以及Superdex 75凝胶层析过滤纯化技术,纯化分析该漆酶的降解代谢底物与抗金属离子抑制能力,确定该漆酶活性最适温度与pH值。【结果】获得本漆酶为65 kDa的单亚基蛋白,总纯化倍数为354.58,比活力17.02 U/mg,该酶N端10个氨基酸的序列为SGGPEQNTTA,经过NBCI-BLAST后发现该漆酶与糙皮侧耳、杂色云芝等的漆酶具有同源性。本漆酶底物差异性较大,从强到弱主要为ABTS>二甲氧基酚>甲苯胺。最适pH值为2.2,属中低温活性;最适反应温度为40℃,为中低温活性漆酶。Cu²⁺对该漆酶催化ABTS有轻微促进作用,Hg²⁺对其催化ABTS有很强的抑制作用。【结论】巴尔喀什蘑菇子实体漆酶为65 kDa的单亚基蛋白,是一种中低温活性耐酸性漆酶,底物特异性为ABTS>二甲氧基酚>甲...     

毛栓菌木聚糖酶的纯化

[目的]进一步研究毛栓菌木聚糖酶的酶学性质。[方法]对毛栓菌木聚糖酶的粗酶液进行硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析S、ephadexG100柱层析3步纯化,探讨木聚糖酶的产酶曲线及纯化方法。[结果]毛栓菌在最适培养基中培养时,木聚糖酶活力从第2天迅速提升,第8天达高峰,随后下降。经饱和度为30%~70%的硫酸铵分级沉淀后,酶活力回收率为84.931%,蛋白质含量为粗酶液的24.640%,纯化倍数为3.445。经DEAE-纤维素离子交换层析后,酶活力回收率为44.345%,酶蛋白纯化倍数为11.772。经SephadexG100柱层析后,酶活力回收率为20.201%,酶蛋白纯化倍数为16.123。[结论]毛栓菌木聚糖酶的粗酶液经过3步纯化后,酶活力回收率达20.201%,酶蛋白纯化倍数达16.123。     

DFRKN-1碱性磷酸酶的纯化研究

以根结线虫天敌1号分离物为提取碱性磷酸酶的材料,菌体经液氮研磨破碎后,用正丁醇抽提,硫酸铵分级沉淀分离,透析获得酶的粗提取液.再经过DEAE-52离子交换和SephadexG-150分子筛两步层析得到纯化倍数为27.17、比活力达10 514U/mg的碱性磷酸酶.     

CXJZ95-198菌株β-甘露聚糖酶的纯化条件研究

研究通过超滤、硫酸铵沉淀、丙酮沉淀及凝胶层析等纯化步骤,将CXJZ95-198菌株所分泌的β-甘露聚糖酶进行了纯化,其纯化倍数为12.05,收率为33.50;.通过SDS-聚丙烯酰胺电泳得到单一条带蛋白,分子量为52.29 kD.     

Roseomonas JS018有机磷农药降解酶的纯化

本试验对能高效降解几种有机磷农药菌株JS018的降解酶进行分离和纯化.经分析该降解酶主要位于细胞间质,最适盐析硫酸铵饱和度为60%-70%,粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和DEAE-52柱层析得到较高纯度的酶液.通过SDS-PAGE电泳测定该酶相对分子质量约为37 ku,N末端16个氨基酸残基测序结果为:GAPFQNDVPPACYRFR.     

2种阴离子交换柱对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果

【目的】比较Q-Sepharose Fast Flow和DE-52 2种阴离子交换柱对1株脂环酸芽孢杆菌Alicycloba-cillus contaminans发酵产生的α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果,为α-葡萄糖苷酶的规模化生产提供技术支持。【方法】采用硫酸铵分级沉淀法对发酵液中的蛋白质进行沉淀,以分离纯化后的蛋白质含量和酶活为指标,对2种阴离子交换柱的分离纯化效果进行评价。【结果】经过Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱分离得到的α-葡萄糖苷酶有1个酶活吸收峰,最大酶活为6.99×103 U,在这个吸收峰内蛋白质的含量稳定在26.25μg/mL左右;经过DE-52阴离子交换层析柱分离,α-葡萄糖苷酶的酶活范围较大,最大酶活为5.56×103 U,在酶活吸收峰内,蛋白质含量为21.25～232.5μg/mL,变化范围较大。【结论】Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱对α-葡萄糖苷酶的分离效果优于DE-52层析柱。     

近缘毛壳Chaetomium subaffine LB-1抑菌物质存在部位及提取方法

【目的】对近缘毛壳Chaetomium subaffine菌株LB-1产生抑菌物质的部位及提取方法进行研究,为开发生防菌株LB-1防治植物病害奠定基础。【方法】以番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和玉米大斑病菌Exserohilum turcicum为指示菌,采用平板密封培养法检测菌株LB-1是否产生挥发性抑菌物质;采用菌体超声破碎和液态培养的方式检测菌株LB-1产生的非挥发性抑菌物质存在的部位;采用含毒培养基法和滤纸片法检测菌株LB-1培养液的硫酸铵沉淀、盐酸沉淀和有机溶剂萃取物的抑菌效果,以确定菌株LB-1培养液中抑菌物质的提取方法。【结果】菌株LB-1与2种供试病原菌密封共培养时,对病原菌的生长没有明显影响,表明菌株LB-1不能产生挥发性抑菌物质。菌株LB-1菌体胞内提取物的抑菌活性与对照无差异,但其培养液对B. cinerea和E. turcicum的生长有较强的抑制作用,表明菌株LB-1产生的抑菌物质存在于菌体细胞外。菌株LB-1培养液的硫酸铵沉淀和盐酸沉淀对2种供试植物病原真菌的生长均无抑制效果,但有机溶剂萃取可获得菌株LB-1培养液中的抑菌物质,其中正丁醇萃取物...     

大豆根际溶磷菌分离鉴定及溶磷过程中有机酸的分泌

【目的】明确吉林省地区大豆Glycine max根际溶磷菌的种类及溶磷特点。【方法】利用溶磷圈法筛选溶磷菌,16S rDNA序列测定和Vitek2生理生化系统对菌株进行分析鉴定。测定菌株生长量、溶磷量、培养基pH变化与有机酸的产生。【结果】从大豆根际土壤中分离获得4株溶磷菌株WJ1、WJ3、WJ5和WJ6。4个菌株分别属于假单胞菌属Pseudomonas sp.、肠杆菌属Enterobacter sp.、苍白杆菌属Ochrobacterum sp.和克雷伯菌属Klebsiella sp.。4株溶磷菌96 h内最大溶磷量分别为558、478、596和586μg·m L-1。甲基红试验和培养物p H测定结果表明:4个菌株在溶磷过程中可使培养物的pH下降,当p H小于4时,会明显阻碍菌株的生长。p H为5时,WJ1和WJ3的生长受到轻微的影响,WJ5和WJ6能正常生长。GC-MS对菌株在溶磷过程中产生的有机化合物的分析表明,4菌株均分泌多种有机酸,其中α-酮戊二酸在WJ1、WJ3和WJ6菌株溶磷过程中大量产生。【结论】4菌株具有较好的溶磷能力,溶磷过程中分泌有机酸种类不完全相同,有机酸的分泌造成培养基的p H降低,影响菌体生长,而菌体数量决定各菌株的溶磷量。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp,其完整开放阅读框为762bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具...     

孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析

观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181～219+153～224、95～131+170～175和24～31+47～55;脊椎骨数分别为46～48、37～39和55～57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化.     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

犬蠕形螨混合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的病原鉴定与诊治

为了对1例皮肤病患犬进行诊断和有效治疗。结合患犬临床症状，采用寄生虫学、血液学和微生物学等方法进行诊断检查，并进行对因和对症治疗。结果显示，经皮肤刮片和皮肤细胞学镜检，观察到犬蠕形螨；血常规和生化指标检查显示白细胞数和中性粒细胞数显著升高、总蛋白含量升高，表明患犬有严重慢性感染和炎症；细菌分离培养获得1株呈金黄色菌落的革兰氏阳性菌和1株呈乳白色菌落的革兰氏阴性菌，利用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；药敏试验结果显示2种细菌均对丁胺卡那霉素敏感，而对其他8种药物存在耐药差异；经选用多拉菌素抗犬蠕形螨治疗、丁胺卡那霉素抗菌治疗，结合对症治疗和提高犬体免疫力等综合治疗方法，连续治疗4周后，患犬病症消失，生理生化指标恢复正常，治疗效果明显。本治疗方法可为犬蠕形螨混合细菌感染的诊治提供参考。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

中国小黄黝鱼种群遗传结构和分化研究

小黄黝鱼(Micropercops swinhonis)是广布于中国长江及北方各水系的一种小型淡水虾虎鱼类。本研究采集了来自松花江(哈尔滨)、辽河(沈阳)、海河(北京)、黄河下游(濮阳)、高邮湖、长江水系(邵阳资水、洪湖、荆州、靖江市、巢湖、太湖、郎溪、洞庭湖)和云南腾冲的88个样品。通过分析线粒体细胞色素b(Cyt b)和控制区D-loop基因序列的变异研究小黄黝鱼不同地理种群的相互关系,并探讨其遗传结构和物种分化。Cyt b和D-loop的序列串联共得到63个单倍型,133个变异位点。AMOVA、SAMOVA、网络图以及贝叶斯建树分析结果都支持将其分为邵阳资水种群(A种群)、太湖种群(B种群)、其他地区种群(C种群)3个差异较大的分支,其中C种群又大致可以分3个子种群。错配分布分析表明靖江(Fu’s FS:-4.119,P=0.009)和洪湖(Fu’s FS:-2.814,P=0.016)两地的种群历史上发生过种群扩张。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。