一株香蕉内生细菌挥发油成分及抑菌活性研究

测定一株香蕉内生细菌BEB99发酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌4号生理小种的(FOC4)菌丝生长和孢子萌发的影响,并测定粗提物中的主要成分。研究结果表明：其发酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均具有明显抑制作用,可造成病菌菌丝的畸形,抗菌物质浓度为1.67 mg/mL时,其孢子萌发抑制率分别达到92.99%和82.96%。GC/MS分析从粗提物中鉴定到18个成分,其中主要成分包括油酸(14.98%)、油酸乙酯(11.38%)、亚麻油酸乙酯(14.86%)、亚油酸(13.20%)、棕榈酸(11.36%)和棕榈酸乙酯(11.26%),及一个未知化学成分。     

一株香蕉拮抗内生细菌的分离及鉴定

从健康的香蕉组织内分离获得22株内生细菌,从中获得1株对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense）1号与4号小种具有抑制作用的拮抗菌(编号为BEB9）,经形态学、生理生化及16S rDNA序列鉴定等方面研究,确认为伯克霍尔德菌。研究还发现NA和YE培养基是其抑菌作用最适培养基。     

香蕉枯萎病菌分子检测研究进展

香蕉枯萎病是全世界香蕉产业共同面临的毁灭性病害,但目前生产上仍缺乏适宜的抗病品种和有效的治疗措施。因此,借助快速准确的枯萎病菌检测技术及时明确病原菌以控制该病的传播和蔓延显得尤为重要。本文回顾了近年来国内外香蕉枯萎病菌分子检测技术的发展历程,归纳和总结了DNA指纹图谱、普通PCR、多重PCR、荧光定量PCR及等温扩增技术在该病菌检测中的研究进展,分析了不同检测技术的优缺点,并指出可能存在的问题和研究发展方向,为该病的分子检测技术优化和防控策略制定提供参考。     

一株芝麻枯萎病菌的鉴定及其生物学特性

为明确发生在南阳芝麻田块的芝麻枯萎病菌原物,以有效防治病害,从南阳市采集枯萎病显症芝麻植株,用常规组织分离法获得一株镰刀菌ZY-2,依据柯赫法则确定ZY-2对芝麻幼苗的致病性,显微观察形态特征,检测生物学特性,并依据核糖体基因内转录间隔区（rDNA-ITS）序列和翻译延伸因子1α基因(tef)序列对该菌进行分子鉴定。在基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树中,菌株ZY-2与2株尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的参比菌株（GenBank登记号：AF69310和EU285553）在自举值98%相聚一群。在基于tef基因序列构建的系统发育树中,菌株ZY-2与3株F. oxysporum的参比菌株（GenBank登记号：KF030591、KF301636和FJ985299）在自举值100%相聚一群。该菌适宜生长温度为22~31℃,最适为28℃;pH2.0~10.0范围内均可生长,最适为pH6.5~7.5;能利用多种碳源和氮源进行营养生长,但在以葡萄糖和L-脯氨酸分别作为唯一碳源和氮源的培养基上不产生分生孢子。      

香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。     

香蕉枯萎病菌假定分泌蛋白SP10的功能分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型假定分泌蛋白基因SP10的在致病过程的作用,构建SP10基因敲除菌株,分析SP10敲除菌株的表型特征。结果表明:SP10基因敲除菌株在菌丝生长、产孢和菌落形态等方面无明显变化,但SP10基因敲除菌株对巴西蕉的致病性减弱;在接种30 d后,采用共聚焦显微镜显微观察香蕉根系,结果显示,SP10基因敲除菌株可在根系维管束中定殖。上述结果表明,假定的分泌蛋白SP10参与调控尖孢镰刀菌对香蕉的致病性,但不参与该病原菌生长和发育的调控。此结果为进一步研究尖孢镰刀菌分泌蛋白的功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌cyp1基因的克隆与序列分析

为了解亲环素基因(cyp1,其编码亲和蛋白)在尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异,分析cyp1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系,通过比对现有镰刀菌属的亲环素基因序列,设计并合成引物,采用PCR和RT-PCR方法扩增了尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号2个生理小种的cyp1基因,并测序进行比较分析,同时对编码蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析。结果表明,2个生理小种cyp1基因全长均为1066bp,开放阅读框均为675bp,编码224个氨基酸,基因序列间差异性为0.8%,编码蛋白间仅存在1个氨基酸的差异;两生理小种的cyp1基因序列与镰刀菌属其他专化型或不同种间存在差异性,与不同属之间其他种间的差异最大达50%,比对蛋白序列发现仅存在0.85%的差异,这进一步证明亲和蛋白在真菌中较保守。从cyp1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测,2个生理小种寄主选择性差异与cyp1基因并无明显对应关系,这为进一步研究cyp1基因功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌esyn1基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法扩增了香蕉枯萎病菌恩镰孢菌素合成酶基因esyn1的cDNA片段,测序结果表明,esyn1基因核苷酸序列阅读框架全长546 bp。核苷酸序列分析显示该基因片段编码181个氨基酸,推测分子量为19.9 ku,等电点为5.06。氨基酸序列比对结果表明,它与半裸镰刀菌、层出镰刀菌、拟枝孢镰刀菌esyn1基因的氨基酸序列的相似性分别为96%、94%、77%。     

内生拮抗细菌BEB2的分子鉴定及其对香蕉枯萎病菌的抑制作用

利用聚合酶链式反应(PCR)方法对细菌BEB2做进一步的分子鉴定,并研究不同温度、pH值和培养基下BEB2发酵液对香蕉枯萎病菌生长的抑制能力.以及应用BEB2对香蕉枯萎病进行防治测试.结果发现,香蕉内生拮抗细菌BEB2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);不同温度、pH值和培养基下的BEB2发酵液对香蕉枯萎病菌生长的抑制能力具显著差异,在King B2培养基上抑菌作用最强,最适抑菌温度为32℃,最适抑菌pH值为9.0.香蕉枯萎病盆栽防治实验结果发现,菌株接种离体叶片和植株均表现出一定的抑制活性,防治效果良好;该菌株连续20次转接培养,遗传稳定性高,抑菌谱较宽,具一定的生防应用价值.     

3种碳源条件下香蕉枯萎病菌次生代谢物合成基因的表达谱分析

在前期获得的香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc）转录组数据基础上,本研究利用antiSMASH、PHI-base数据库对3种碳源条件下香蕉枯萎病1号小种（Foc 1）和4号小种（Foc 4）表达的次生代谢物合成基因进行了预测和表达谱分析。结果表明：3种碳源条件下,Foc共有486个候选的次生代谢物合成基因表达,并分类到32个次生代谢产物合成基因簇,其中13个基因可能与Foc的致病性相关。此外,Foc在3种碳源条件下次生代谢物合成基因的表达模式存在明显差异,特别是在寄主细胞壁条件下Foc差异表达的次生代谢物合成基因最多;而且Foc 4相较于Foc 1在侵染寄主细胞壁时有更多的次生代谢物合成基因特异表达或高表达。以上研究结果将为进一步明确次生代谢产物在Foc致病过程中的作用机理提供理论依据。     

香蕉枯萎病菌的致病性测定及其RAPD分析

以分离自海南、广东的18个香蕉枯萎菌菌株为试验材料,进行致病性测定及RAPD分析.结果表明,分离自粉蕉的12个菌株为1号生理小种,而分离自巴西蕉的6个菌株为4号生理小种;1号生理小种菌株侵染粉蕉的发病率与4号生理小种菌株侵染粉蕉、巴西蕉的发病率都是100%;采自海南三亚市荔枝沟镇的15号菌株为强致病性的菌株,与其它5个4号小种菌株相比,差异显著;RAPD分析能区分1号4号生理小种,菌株的地理来源,致病力;引物OPM-15能用来鉴定1号和4号生理小种.     

不同香蕉品种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白活性的比较

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种富含亮氨酸重复区域的蛋白质,能够非竞争性地抑制真菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性.以目前生产上几个主要抗枯萎病的香蕉品种为材料,参照Gross的PGIP活性测定方法,通过测定了Musa AAA、Musa ABB、Musa ABB、Musa AA和Musa AAAB等不同细胞基因型的香蕉品种的PGIP活性,发现东莞大蕉(Musa ABB)的活性最高.通过对东莞大蕉根、假茎、叶不同部位的PGIP活性比较,发现假茎的活性最高.用香蕉枯萎病菌4号生理小种接种诱导东莞大蕉能明显提高PGIP活性,观察还发现东莞大蕉苗期PGIP的活性明显高于后期.     

16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性初析

采用16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性进行初步研究,随机选择12个阳性克隆测序。结果表明,该序列与未培养及可培养的芽孢杆菌、雷尔氏菌、伯克氏菌、戴尔福特菌、肠杆菌等细菌的序列同源性在97%～100%之间,说明香蕉根部存在大量未培养及可培养的内生细菌。     

甘蔗茎部内生细菌的分离及分子鉴定

采用稀释涂板法对广东省广州市白云区国家农业科技园区内的甘蔗茎部内生菌进行分离,同时进行16S rDNA扩增检测及同源性分析。结果表明：共分离获得20株不同的内生菌,所获得的内生菌分属于6个类群（Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Firmicutes、Acidobacteriales）、16个属（Staphyococcus,Leifsonia、Kineococcus、Frondihabitans、Curtobacterium、Microbacterium、Amnibacterium、Methylobacterium、Rhizobium、Terriglobus、Sphingomonas、Acidisoma、Stenotrophomonas、Enterobacter、Burholderia、Variovorax）,其中,Actinobacteria和Alphaproteobacteria类群占总数的65％。除SC-4、SC-11与其同源细菌相似性分别为97％、96％外,其余分离菌与同源菌相似性均在98％以上。本研究结果在一定程度上反映了甘蔗茎部内生菌具有较高的多样性。     

不同产区青稞根部可培养内生固氮菌的多样性研究

为认识青稞内生固氮菌群落组成,丰富内生固氮菌资源,明确产地对青稞内生固氮菌多样性的影响,本研究利用纯培养技术分别对在拉萨、林芝、日喀则栽培的藏青2000根部内生固氮菌进行分离、纯化,并测定各菌株的固氮酶活性及高固氮酶活性菌株的溶磷、溶钾及产IAA特性,最后,通过16SrDNA基因测序和构建系统发育树研究了高固氮酶活性菌株的分类学地位。结果显示,通过Ashby培养基分离、纯化得到内生固氮菌37株,其中,具有高固氮酶活性的11株,占总分离菌株27%,有6株菌株具有分泌IAA的能力,2株具有溶钾能力,1株具有溶磷能力。16S rDNA测序结果表明,11株高固氮酶活性的菌中,有5株菌属于Bacillus,为优势菌属,其余菌株分别属于Gemmatimonas、Sphingomonas、Devosia、Agrobacterium、Mesorhizobium和Burkholderia。     

拮抗大豆疫霉菌植物内生细菌的筛选与鉴定

大豆疫霉根腐病是世界范围内危害严重的毁灭性大豆病害,筛选内生菌进行生物防治是未来该病害防治的重要发展方向.以大豆根系为材料筛选得到67株内生细菌,采用平板对峙生长实验,发现其中18株对大豆疫霉菌的菌丝生长具有抑制作用,其中以A2、A4、A7和B8效果最佳,抑制率分别达到72.8％、55.5％、76.0％和87.1％.利用无菌发酵滤液与大豆疫霉孢子共培养发现,A2和A4对孢子萌发具有明显抑制效果,抑制率达75.4％和85.8％.盆栽实验表明,A2和A4无菌发酵滤液能使经大豆疫霉孢子侵染后的大豆种子萌发率由63.1％分别提高到80.0％和80.3％,健康幼苗率由31.4％提高到45.7％和50.9％.根据16S rDNA序列系统发育分析,初步确定A2为假单胞菌(Pseudomonas sp.),A4、A7和B8皆为芽孢杆菌(Bacillus sp.).     

浅析棉花内生细菌及其作为生防因子的研究

通过对国内外有关内生细菌及其作为生防因子在棉花上的研究与应用文献的阅读与理解,概括了棉花内生细菌的种类、种群动态以及研究方法,综述了国内外棉花内生细菌作为生防因子的研究进展及其生防抑菌机理,探讨了在棉花内生细菌研究中存在的问题及发展趋势,为国内同仁开展棉花内生细菌及其作为生防菌的研究与应用提供参考。