禽流感病毒的分子生物学特性及其检测技术的研究进展

禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一种禽类感染和/或疾病综合征,在许多国家给家禽养殖业带来巨大的经济损失,而且威胁到人类的健康和安全.从禽流感病毒（AIV）的分子生物学特性及检测技术的最新研究进展进行了概述,重点介绍了禽流感诊断技术的最新研究及进展.     

禽流感病毒、新城疫病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒多联RT-PCR诊断技术的建立

选择禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒（NDV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列高保守区，按照多联PCR引物的设计要求，利用DNAsis计算机软件设计并合成了4对特异性扩增引物，扩增片段大小分别为470、320、200和140bp。以AIV、NDV、CSFV和FMDV的培养物提取RNA并反转录，进行RT-PCR特异性扩增。结果表明，各单项RT-PCR扩增产物与设计的4对引物之间的序列大小一致。在分别建立了各病毒单项RT-PCR及AIV与NDV、CSFV与FMDV二联RT-PCR的基础上，进一步优化各种多联PCR扩增条件，成功建立了上述4种病毒的四联RT-PCR技术。经特异性和灵敏度实验证明，本方法具有高度的特异性和灵敏性，其灵敏度为10pg总RNA。在3h内即可完成样品的检测。     

表达禽流感病毒核蛋白重组噬菌体的构建

摘要：利用PCR技术，扩增去除部分序列、长度为1320 bp、编码440个氨基酸的禽流感病毒(AIV)NP基因片段，将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR-NP，以此重组载体转化大肠杆菌E2，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-Z1感染重组E2菌，重组载体与缺陷噬菌体T4-Z1基因发生同源重组，将NP基因整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-Z1-NP。经Western blot检测证实，T4-Z1-NP表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。成功构建了表达禽流感病毒核蛋白的重组噬菌体。     

禽流感病毒H5亚型金标快速诊断技术方法的建立及试剂盒研制

应用纯化禽流感病毒(AIV)H5抗原免疫Balb/c小鼠,得到2株配对良好的抗AIV H5单抗;采用金标免疫层析法制备AIV H5亚型金标快速诊断试剂盒,并对试剂盒性能进行评价.实验结果表明,AIV-H5金标试剂盒与AIV H5以外其它亚型及其它禽类病毒不发生交叉反应,其灵敏度达1/27,稳定性良好:试剂盒检测人工感染AIV H5的鸡脏器组织,结果除心脏、泄殖腔拭子和喉拭子外,其余脏器均呈阳性,与鸡胚病毒分离培养结果相符;田间试验结果与荧光RT-PCR试剂盒检测符合率达100%.     

流感复合多表位疫苗的设计及小鼠免疫研究

鉴于目前出现了多种亚型禽流感病毒共存的局面,研究多价流感疫苗具有重要意义。根据各表位的免疫学特性,结合分子生物学信息软件的模拟功能,以H 3、H 9亚型流感病毒的HA抗原表位、流感病毒的其他主要抗原(NP、NA、M)表位的基因为基础,再附以K ozak序列和适当的酶切位点,设计并合成大小为765 bp的复合多表位基因盒-Ep。i将Ep i基因克隆入真核表达载体pIRES1neo中,构建DNA重组体pIR-Ep i;将H 7HA、Ep、iH 5HA基因以融合表达方式克隆到pIRES1neo中,构建了DNA重组体pIRE-H 57-Ep。i以上述构建的DNA重组体与鸡痘病毒重组株对BALB/c小鼠进行免疫接种后,检测体液与细胞免疫指标。研究结果表明,流感病毒复合多表位DNA重组体pIRE-H 57-Ep、ipIRE-Ep i免疫组小鼠均能产生针对H 3亚型流感病毒的特异性抗体,抗体效价(1∶1 600~1∶6 400)低于灭活疫苗免疫组(1∶12 800),但均高于其他对照免疫组(P<0.01)。pIRE-H 57-Ep i免疫组抗H 5、H 7 HA抗体效价分别为1∶12 800和1∶6 400,均高于其他免疫组(P<0.05)。pIRE-Ep i免疫组抗H 5、H 7HA抗体效价(1∶200,1∶100)较低,与其他对照免疫组差异不显著。pIRE-H 57-Ep i与pIRE-Ep i免疫组抗H 9亚型A IV的HA抗体效价(1∶6 400,1∶3 200)明显高于其他免疫组(P<0.05)。与PBS对照组及空质粒pIRES1neo对照组比较,用所构建的重组体免疫的各试验组小鼠的T淋巴细胞亚类CD 4 和CD 8 的数量显著提高(P<0.05)。pIRE-H 57-Ep i与pIRE-Ep i试验组的CD 4 与CD 8 淋巴细胞的数量较灭活苗显著增多(P<0.05),而各重组体免疫组之间差异不显著。此外,所有组的CD 4 /CD 8 比值均稳定在1.5~2.0,表明无异常免疫应答出现。EL ISPOT检测小鼠脾淋巴细胞分泌IFNγ-斑点数实验结果表明,pIRE-H 57-Ep、ipIRE-Ep i试验组的IFNγ-斑点数量(>70)比灭活苗(<40)显著增多(P<0.05),而各重组体免疫组之间差异不显著。上述结果说明,所构建的DNA重组体有良好的免疫原性,为最终获得能同时预防多种亚型流感病毒的多价疫苗奠定了基础。     

H5N1型禽流感病毒血凝素HA1蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示及其免疫原性

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示H5N1型禽流感病毒HA1蛋白的可行性及其免疫原性，为研制既安全有效又能常温长期保藏和运输的禽流感口服基因工程疫苗奠定基础。用部分ha1基因（ha1p）代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段，构建了融合基因ctc-ha1p和 csa-ctc-ha1p；利用电脉冲转化法将含融合基因的重组质粒转入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中，获得了重组菌株BCCH（含ctc-ha1p，并导入一个载有协助细胞表面展示的csaAB操纵子的质粒）和CH（含csa-ctc-ha1p）。通过血凝和血凝抑制试验以及小鼠免疫学实验证实，2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组HA1蛋白并具有一定的特异性和免疫原性，其中，CH的效果强于BCCH，说明csa-ctc-ha1p这种融合基因的构建方式更胜一筹。研究结果表明，苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可用来研制禽流感口服疫苗。     

我国南方甘蔗病毒种类初步鉴定

依据G enB ank中已报道的甘蔗主要病毒基因组序列设计PCR引物,以采自我国广东、广西、云南、海南等地的甘蔗叶组织总RNA或总DNA抽提物为模板,采用一步法RT-PCR及PCR扩增,对预期扩增产物克隆、测序,根据序列同一性判断测定样品是否含有预期病毒,结果表明,我国南方甘蔗已受到甘蔗花叶病毒(Sugarcane m osa ic v irus,SCM V)、高粱花叶病毒(Sorghum m osa ic v irus,S rM V)、甘蔗黄叶病毒(Sugarcane ye llow leaf v irus,SCYLV)及甘蔗杆状病毒(Sugarcane B ac illiform V irus,SCBV)的侵染,未发现甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak m osa ic v irus,SCSM V)及甘蔗线条病毒(Sugarcane streak v irus,SSV)。     

湖南湖北两省H_6亚型禽流感病毒表面基因的序列分析

2008年至2009年间,在湖南和湖北两省的活禽市场中分离到了14株H6亚型禽流感病毒,为了解这14株病毒之间的分子特征和差异,我们运用PCR和测序鉴定对这14株病毒的NA基因进行了分型,并对其表面基因HA和NA进行序列测定及序列分析。14株H6亚型病毒中,H6N2亚型12株,H6N6亚型2株。序列测定和进化分析结果显示：DK/HN/284的HA基因与其它13株的HA差异性较大,差异性达到19.4%～20.2%,其余13株毒同源性在94.2%～99.9%;N2亚型NA基因的同源性在91.1%～99.9%,差异性比较大;两株N6亚型NA基因同源性为89.5%,差异明显。这些数据表明：不同毒株呈现一定的地域性差异。与我国周边其它地区的H6亚型禽流感毒株序列进行比较发现,只有DK/HN/284的HA基因与香港早期的毒株可能有着共同的来源,其余都与香港和韩国等的毒株有着较大的差异性,并且各个毒株的HA基因上潜在的糖基化位点和受体结合位点也有所不同,这些数据表明,这些毒株表现出明显的异源性。     

两株H3N8亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性

H3N8亚型流感病毒宿主范围广泛,除了可以感染野鸟和家禽外,还可以感染多种哺乳动物,并且H3N8亚型流感病毒跨物种传播的现象也时有发生,对养殖业和人类生命健康都具有重要威胁.为了解H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的生物学特性,本研究对2013年贵州省分离的两株H3N8亚型AIV(A/duck/Guizhou/S 1092/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1092/2013)和A/duck/Guizhou/S1145/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1145/2013))进行了遗传演化分析、小鼠(Mus musculus)感染性实验和受体结合特异性实验.遗传演化分析结果表明,这两株病毒具有明显的遗传多样性,除了血凝素(hemagglutinin,HA)基因位于同一个进化分支外,其他7个基因片段均具有不同起源.感染性实验结果表明,这两株病毒不需要提前适应就可以在小鼠的肺脏和鼻甲内有效复制,对小鼠呈现低致病性,小鼠感染病毒后未出现明显临床症状,目.DK/GZ/S1092/2013仅引起小鼠的体重下降1.8％,DK/GZ/S 1145/2013仅引起小鼠的体重下降0.8％.受体结合特异性分析结果表明,这两株病毒同时具有结合禽源唾液酸(sialic acid,SA) α2,3-Gal受体和人源SA α2,6-Gal受体的能力,具有感染人类的潜在风险.本研究通过对两株H3N8亚型AIV的生物学特性进行系统分析,发现H3N8亚型AIV具有感染哺乳动物的潜在风险.研究结果对于H3N8亚型AIV的综合防控具有重要的指导意义.     

禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70％;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一.本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) (A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01 (H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析.首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得cDNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切将其定向插入pGEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达.该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出.为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析.结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90％以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S 1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好.研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料.     

一株对小鼠具有高致病性的H5N1亚型禽流感病毒的拯救

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus)正在逐渐获得突破种间屏障感染哺乳动物的能力,揭示其获得此种能力的分子机制已经成为禽流感病毒的研究热点。A/Chicken/Guangdong/04(H5N1)是一株高致病性禽流感病毒,同时对BALB/c小鼠也具有高致病力。实验通过反向遗传操作技术对该病毒进行拯救,获得了拯救毒R-A/Chicken/Guangdong/04(R-CG)。R-CG与其亲本毒A/Chicken/Guangdong/04(W-CG)在胚半数感染量(EID50)、细胞培养半数感染量(TCID50)、对SPF鸡和BALB/c小鼠致病力等生物学特性保持一致。即R-CG与W-CG对鸡都为高致病力,静脉接种指数分别为2.88和2.91;R-CG与W-CG一样,以106EID50鼻腔感染BALB/c小鼠后,均能引起小鼠死亡,在小鼠脑、肺、肾和脾脏中都能分离到病毒,说明拯救的病毒与亲本毒一样,都可在小鼠体内有效复制,对小鼠具有高致病性。本实验成功地拯救了A/Chicken/Guangdong/04,拯救病毒R-CG可作为背景毒株,为研究禽流感病毒突破种间屏障感染哺乳动物的分子机制奠定了实验基础。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a（＋）-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B（DE3）中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

人参果主要病毒检测方法研究

为了给人参果病毒检验及抗病性研究提供支持,对人参果采用ELISA和RT-PCR两种检测方法对8份田间材料中的马铃薯M病毒(PVM)、番茄花叶病毒(ToMV)和烟草花叶病毒(TMV)进行检测,对比筛选病毒检测方法。结果表明,ELISA法检测PVM的阳性检出率为87.5%;ToMV为37.5%,疑似率为12.5%;TMV为37.5%。通过RT-PCR检测体系,从人参果样品中分别扩增出与试验设计大小相符的特异条带,PVM阳性检出率为100%,ToMV为 50.0%,TMV为37.5%,检测灵敏性和准确性更高,检测结果符合率在87.5%以上。对扩增阳性产物进行凝胶回收测序,确定为目标条带。