抗HepG2核糖体展示抗体库的构建

[目的]构建鼠源抗HepG2核糖体展示抗体库。[方法]以培养的HepG2肝癌细胞4次免疫Balb／c小鼠,取脾脏分离总RNA,逆转录合成第一条链,PCR扩增重链可变区和轻链k,经linkerDNA连接形成VH／k核糖体展示抗体库。将VH／k与pMD18-T载体的连接产物转化E．coliTGI,蓝白斑筛选,挑取白色菌落,提取质粒,PCR鉴定,并测序。[结果]VH和k链得到正确的扩增,长度分别为399和6476p,VH／k连接产物正确,连接产物长度为10936p：[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗Hepc2核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗HepG2特异性单链抗体奠定基础。     

抗 ICOSL 核糖体展示单链抗体库的构建

[目的]构建出鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库。[方法]通过RT—PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT—PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker（VH—linker）序列,以及轻链可变区和Linker（VK—linker）序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH／K与pMD19一T载体链接产物转化E．coliDH50L,PCR鉴定并测序。[结果]VH和κ链得到正确的扩增,长度分别为421和689bp,V14／κ连接产物正确,连接产物长度为1079bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗IcosL特异性单链抗体奠定基础。     

核糖体展示技术的研究进展

综述了核糖体展示技术的原理、构建元件、无细胞系统的选择、展示流程以及应用等,并展望了该技术今后的发展方向。     

弓形虫速殖子噬菌体展示文库的构建

目的构建弓形虫速殖子λ噬菌体展示文库,为后期免疫筛选做准备。方法通过Trizol试剂提取弓形虫RH株速殖子总RNA,再利用SMART技术进行反转录合成双链cDNA。对cDNA进行纯化后,通过Sfi I酶切消化双链cDNA并切胶回收,与λTripIEx2载体的两臂连接,最后通过λ噬菌体包装蛋白进行体外包装,以构建λ噬菌体展示文库。对文库进行滴度测定,并进行重组率检测。结果 RNA提取结果良好,未扩增文库滴度为8.0×10~6 pfu·mL~(-1),文库重组率为95%。随机挑取50个噬菌斑进行PCR鉴定,插入片段分布在0.5～3 kb。结论成功构建了弓形虫速殖子λ噬菌体展示文库,为后期疫苗的研究奠定基础。     

PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库的构建及鉴定

【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头,再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNAT7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL,扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95．83％,且插入片段主要分布于500-2000bp,其中500～750bp的占21．73％,750～100bp的占21．73％,1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。     

新疆双峰驼纳米抗体噬菌体展示文库多样性的生物信息学分析

[目的]骆驼免疫系统中只存在重链抗体,其可变区VHH片段是最小的天然抗体片段.通过对双峰驼VHH基因进行序列分析,了解双峰驼VHH基因特征,分析VHH文库多样性组成.[方法]采用新疆双峰驼VHH特异引物扩增全部抗体基因片段,连接到M13噬菌粒载体上,与pⅢ蛋白融合表达在噬菌体表面,构建噬菌体展示文库.基因测序和菌落PCR方法,分析文库大小和阳性克隆插入率.NCBI-IgGBLAST工具对抗体序列进行IMGT编号命名,WebLogo工具分析抗体保守序列分布频率,MEGA6软件对VHH序列进行同源性比对和系统进化树构建.[结果]利用免疫的新疆双峰驼淋巴细胞,构建了库容量为1.4 ×109的VHH抗体噬菌体展示文库.对91个随机挑选的文库TG1单菌落进行PCR.结果表明该文库VHH阳性插入率为97;,DNA测序表明文库多样性为97.8;.对91个克隆DNA测序结果进一步分析表明,这些基因中除2个为常规VH抗体外,其余均为重链VHH抗体.根据抗体序列中的特征氨基酸分布,将91个抗体序列划分为7个亚群.[结论]构建的新疆双峰驼VHH文库多样性较好,生物信息学分析揭示出文库中多样性克隆的分布和特征,有助于新疆双峰驼纳米抗体噬菌体展示文库的进一步构建.     

鸡法氏囊三肽囊素阳性细胞cDNA酵母展示文库的筛选

在禽类和哺乳类中存在的三肽囊素(Bursin),对禽类和哺乳类淋巴细胞具有重要的免疫调节功能及生理学活性.牛骨髓和肝脏中含有三肽囊素(Bursin)序列的前囊素(pro Bursin)的分离使我们假设:在鸟类和哺乳类中存在的三肽囊素可能是由前囊素酶解而来的.为了验证这种假设我们通过提取鸡法氏囊三肽囊素阳性细胞的mRNA、构建cDNA酵母展示文库、对酵母展示文库用流式细胞仪进行三轮抗三肽囊素单克隆抗体以及FITC标记山羊抗小鼠IgM单克隆抗体的分选.最后对第3次分选得到的酵母克隆随机挑20个进行测序.这20个克隆中并没有编码三肽囊素的核酸序列,因此我们推测:在鸡法氏囊内三肽囊素不是由其前体囊素的裂解而来,而可能是由一种类似微生物体内低分子量的多肽通过非核糖体途径有多肽合成聚合酶的聚合作用合成的,这需要进一步的试验验证.     

PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库的构建及鉴定

[目的]构建PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础.[方法]分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoRⅠ和Hind Ⅲ接头,再由EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNA T7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量.[结果]经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2.0×105 PFU/mL,扩增后滴度达6.0× 1010 PFU/mL.PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95.83%,且插入片段主要分布于500~2000 bp,其中500~750 bp的占21.73%,750~100 bp的占21.73%,1000~2000 bp的占39.13%.随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列.[结论]构建的PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用.     

单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定

优化噬菌体展示文库构建策略,获得高品质羊驼源天然纳米抗体T7噬菌体展示文库,并对文库质量进行鉴定.分离羊驼外周血淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)基因,插入T7 select 415-1b噬菌体载体构建文库,计算文库的库容量,测定文库传代稳定性.测序分析VHH基因的多样性和纳米抗体氨基...     

小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定

以中国春小麦叶、茎、幼穗及花后3、6、9、12、15、20、25 d的籽粒为材料,利用Gateway技术构建中国春小麦cDNA初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y187酵母菌株构建出酵母双杂交文库。通过mating法筛选小麦粒质量基因TaDAR1的互作蛋白,以此来鉴定文库的有效性。结果表明：初级文库容量为1.82×10⁷ CFU/mL、次级文库的容量为1.91×10⁷ CFU/mL,文库重组率均大于 96%,插入片段平均长度在 1 000 bp 以上。酵母双杂交文库转化效率为1.97×10 CFU/μg,文库容量为2.04×10⁷ CFU/mL。构建诱饵载体pGBKT7-TaDAR1并转化Y2H酵母菌株,经检验存在自激活现象,进一步截断检测发现此蛋白N端无自激活,C端有自激活,以BD-TaDAR1-N为诱饵载体,筛选酵母文库,获得其互作蛋白序列,并命名为TaDAR1IP,经回转验证TaDAR1-N与TaDAR1IP存在相互作用关系。表明本试验方案构建的酵母文库是高质量的有效的。为初学者构建酵母双杂文库及使用“mating”法筛选酵母文库提供借鉴,也为后续小麦基因功能的研究奠定基础。     

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。     

Study on the Coordinated Development of the Construction of Library Legal System and Modem Library

图书馆的法制建设关系到一个现代图书馆的建设与发展。要想图书馆建设成一个现代的,健康的,有发展潜力的现代化图书馆就必须有完善的图书馆法制作为前提。但目前为止我国还没有完善的图书馆法制为现代图书馆建设作保障。建立健全完善的图书馆法及相关法律还存在很多困难,为解决这些问题,促进现代图书馆建设发展,使图书馆法制建设与现代图书馆建设同步协调发展,为此提出了自己的见解和意见。     

人源肺细胞cDNA文库构建及与流感病毒NP互作宿主蛋白的筛选

【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利用长距离PCR(LD-PCR)扩增合成dscDNA,用CHROMA SPINTM+TE-400纯化柱纯化dsDNA,按照Clontech公司的Make Your Own"MatePlate"Library System操作程序,将带有同源臂的dscDNA与线性化p GADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右,收集所有菌落,混匀分装即为Calu-3和A549细胞cDNA的酵母文库,并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005(H5N1)NP定向插入pGBKT7载体,构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒p GBKT7-NP,经验证该质粒无自激活活性,并进一步采用构建完成的Calu-3/A549细胞酵母文库进行杂交筛选,筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌,分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照,挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/Aro A(SD/-4/X/A)固体培养板上生长良好且变蓝的菌落,即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白,提取酵母质粒,进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰,5S条带暗淡,表明所提RNA质量较高,基本无降解;对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA,dscDNA条带呈弥散状,片段大小分布于500—2 000bp之间,说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录;构建的dscDNA文库库容为1.5×10~7,滴度为2.2×10~8cfu/m L,重组率为88%,PCR鉴定文库插入片段,条带大小不一、多样性好;利用诱饵质粒与文库进行双杂交筛选,回交验证后得到11个与NP蛋白互作的宿主因子。经Gene Ontology分析显示,11个宿主因子参与的生物过程包括:细胞凋亡、胚胎发育、可变剪接、转录调节及细胞增殖等;涉及的分子功能包括:GTP结合活性、金属离子结合活性、DNA结合活性及转录因子活性。【结论】成功构建同时含有Calu-3和A549两种人源肺细胞cDNA的酵母文库,文库覆盖cDNA更全面,为后期筛选与流感病毒其它蛋白互作的宿主蛋白奠定基础,筛选得到与NP蛋白存在相互作用的宿主因子为进一步深入研究NP功能提供了可靠的前期数据。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒构建及其免疫原性的研究

 【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。     

副猪嗜血杆菌EZ-Tn5转座子插入突变体库的构建及减毒株的筛选（摘要）

[目的]获得副猪嗜血杆菌减毒株.[方法]应用转座子技术构建转座子插入突变体库,卡那抗性筛选阳性菌株,PCR扩增卡那特异片段去除假阳性,小鼠感染试验检测突变株毒力,并对获得的减毒株进行生物学特性检测。[结果]所获得减毒突变菌株具有与野毒株相似的增殖能力,传代后毒力稳定,遗传学特性稳定。[结论]该研究结果为进一步探讨HPS毒力因子、致病机制奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌EZ-Tn5转座子插入突变体库的构建及减毒株的筛选

[目的]获得副猪嗜血杆菌减毒株。[方法]应用转座子技术构建转座子插入突变体库,卡那抗性筛选阳性菌株,PCR扩增卡那特异片段去除假阳性,小鼠感染试验检测突变株毒力,并对获得的减毒株进行生物学特性检测。[结果]所获得减毒突变菌株具有与野毒株相似的增殖能力,传代后毒力稳定,遗传学特性稳定。[结论]该研究结果为进一步探讨HPS毒力因子、致病机制奠定了基础。     

基于燕赵文化传承创新的高校图书馆阅读推广基地建设研究

中华优秀传统文化的传承与创新是作为保存、传播、继承先进文化的高校图书馆的重要使命。通过完善物质条件、制定管理制度、加强阅读推广队建设、创新阅读推广形式等方面建设高校图书馆阅读推广基地,将优秀的燕赵文化精神在大学生中传播,对提升大学生传统文化修养,营造高校校园文化氛围具有深远的意义。     

用户需求对图书馆文献资源建设、管理与服务促进机制——基于扎根理论的研究

[目的/意义]通过对读者提交的荐购原始数据进行深度分析和解读,挖掘荐购数据包含的潜在信息和多重价值,为更好地发挥读者荐购服务在图书馆资源建设、管理和服务等方面的促进作用提供理论依据。[方法/过程]采用扎根理论方法,对读者荐购数据中“推荐理由”部分做重点解析,从中抽出表达读者深层意思的主要涵义,据此归纳、演绎出相互关联的概念范畴,并发展成理论性概念,进而构建出用户需求对图书馆文献资源建设、管理与服务促进机制模型。[结果/结论]读者荐购数据中包含的信息能帮助采访人员弥补专业局限,揭示资源管理的不足,反映读者在信息素养方面的潜在需求。对荐购信息进行深度研究和利用,有助于图书馆正确评价资源配置和服务配置之间的关系,促进图书馆在资源建设、资源管理、资源服务等多方面提高整体服务水平。