浸酸孵化法解除家蚕滞育的机理研究(Ⅱ)--醋酸解除家蚕滞育机理分析

在蚕卵人工孵化法中,盐酸、硝酸、硫酸、王水等无机酸都能不同程度解除家蚕滞育,它们都含有H ,为了证实H 对家蚕滞育解除的效应作用,笔者用有机酸醋酸与无机酸盐酸作对比,进行蚕卵浸渍,发现有醋酸完全可以解除家蚕滞育.     

不同酸类物质浸渍解除家蚕卵滞育的研究

将不同酸类物质、不同浸渍时间对家蚕卵的孵化效果进行了比较研究,结果表明：硝酸、磷酸、醋酸、温水等都能促进家蚕卵活化而解除滞育。用15％的硝酸刺激适当时间,可以使蚕卵孵化率达到95％以上;用15％的磷酸、15％醋酸可以促使蚕卵孵化,但孵化率偏低,而随着浸渍浓度的逐渐提高,蚕卵孵化效果会越来越好;温水也能促进蚕卵孵化,但孵化率稍差。酸类物质能促使蚕卵解除滞育,效应离子为H＋以及一些氧化酶。     

过氧化氢对盐酸解除家蚕滞育的促进作用研究

产后置于温度为25℃条件下保护16天的家蚕滞育卵，用盐酸和过氧化氢处理，研究了过氧化氢对盐酸解除家蚕滞育的作用。结果表明，48℃、18．4％的盐酸处理能一定程度解除蚕卵滞育性，1mol／L和2mol／L过氧化氢处理，不能解除滞育性而获得孵化能力，但对盐酸的解除作用有显著的促进作用；促进作用大小与盐酸处理时间、过氧化氢浓度、两种处理之间的时间间隔有关。     

适用于实用家蚕品种转基因的蚕卵滞育解除方法

实用家蚕品种转基因是利用分子靶标实现家蚕品种改良与创新的最直接和有效手段,建立高效的适合于转基因显微注射的蚕卵滞育解除方法则是目前家蚕转基因在技术层面尚待解决的关键问题之一。采用早期浸酸、低温催青、复式催青3种方法解除显微注射转基因蚕卵的滞育。结果表明,3种人工处理方法均能解除蚕卵滞育,且获得的非滞育性蚕卵可通过显微注射得到转基因阳性个体,其中采用复式催青法处理的子代蚕卵滞育解除率最高,转基因阳性蛾圈率约25.00%,明显优于低温催青和早期浸酸处理。此外,采用早期浸酸处理,日系品种的蚕卵滞育解除率高于中系品种;采用低温催青和复式催青处理,中系品种子代蚕卵滞育解除率则显著高于日系品种。     

3-氨基三唑与过氧化氢共同处理对家蚕滞育发动的影响

研究有效阻止家蚕滞育发动的措施发现 :在家蚕滞育发动期间 ,仅用过氧化氢酶 (catalase ,CAT)的专一性抑制剂 3 氨基三唑 (3 amino 1,2 ,4 triazole ,AT)处理滞育性蚕卵仍不能阻止家蚕滞育发动 ;但先用AT处理抑制CAT活性后 ,再用H2 O2 处理可有效阻止家蚕滞育发动。     

家蚕二化性品种(品系)转基因用蚕卵的预处理技术研究

家蚕为卵滞育昆虫,二化性家蚕品种(品系)的化性由上代卵期温度与光照等调控。将若干个二化性家蚕品种(品系)以17~18℃温度催青诱导子代蚕卵非滞育,筛选出1个经济性状较优的实用品种"秋丰"、1个突变品系P33,二者非滞育卵圈比例分别达到96.4%和89.6%,正常催青的良卵实用孵化率分别达到96.11%和98.58%,解决了采用显微注射法以家蚕实用品种构建转基因系统过程中因蚕卵滞育不能及时孵化的难题。另对利用20%盐酸-2%甲醛混合液刺激解除蚕卵滞育的方法以及非滞育蚕卵表面用70%乙醇消毒的方法进行了尝试,前者可以获得96%以上的孵化率,后者可以缩短蚕卵预处理时间。     

家蚕滞育解除相关酶类的研究进展

家蚕是典型的卵滞育昆虫,通过滞育可以使家蚕度过不良的生长环境利于其发育繁殖.滞育的家蚕卵可通过低温冷藏和浸酸等方法解除滞育,使胚胎正常发育.对于家蚕卵滞育解除的分子机理已有不少研究,包括从酶类、蛋白质组学、相关信号通路等方面进行探索.文章主要对近几年来家蚕滞育解除过程中的相关酶类研究进行综述,希望给今后相关研究提供参考.     

盐酸刺激活化家蚕滞育性卵的机理研究进展

盐酸刺激活化家蚕滞育性卵的机理研究是家蚕卵滞育与活化机理研究的一个重要方面。本文综述了浸酸后蚕卵的理化性质变化,如卵壳的通透性,卵内某些酶和激素的活性变化及其对蚕卵滞育性的影响,以及蚕卵对盐酸刺激的接受方式等方面的最新研究结果,还阐述了酸刺激量与蚕卵孵化率的关系。     

浸酸孵化法解除家蚕滞育的机理研究(Ⅰ)--H+在解除家蚕滞育中的效应初探

蚕卵人工孵化以盐酸孵化法成效最佳，它不仅可以解除蚕卵滞育，而且具有卵面消毒作用，盐酸孵化法的效应成份是什么呢?目前尚无明确报道，本试验认为盐酸孵化法的效应离子是H^ 。     

家蚕滞育卵中辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的含量变化

利用苹果酸脱氢酶(MDH)和柠檬酸合酶(CS)串联反应以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)催化葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)脱氢反应,分别测定了家蚕滞育发动、即时浸酸和低温冷藏处理蚕卵辅酶Ⅰ(NAD+)和辅酶Ⅱ(NADP+)的含量。滞育发动时蚕卵NAD+含量显著下降,而即时浸酸和低温冷藏处理使蚕卵NAD+含量显著提高。蚕卵中的NADP+在滞育发动前大量积累,滞育发动时下降,即时浸酸处理后NADP+含量显著提高,在低温冷藏早期其含量进一步提高,低温冷藏处理后期又显著下降。分析上述结果认为,家蚕滞育卵中NAD+和NADP+含量的变化分别与呼吸耗氧量和糖元-山梨醇相互转化密切相关。     

盐酸处理蚕卵酯酶A4的活性变化及其与滞育性的关系

从家蚕C108品种蚕卵精制酯酶A4,首次测定了产卵后24～96h浸酸蚕卵酯酶A4的ATPase活性。蚕卵经盐酸处理后在体外5℃1～2d或体外25℃1～3h出现酶活性峰。与低温活化蚕卵比较,产卵后24～96h的浸酸蚕卵,在体外5℃酶活性峰出现时间提早了8．5～22d,在体外25℃提早了3～9h。浸酸后蚕卵迅速解除滞育,滞育发育时间显著缩短。将不同卵龄未浸酸蚕卵与盐酸处理蚕卵酯酶A4的ATPase活性峰出现时间差制成曲线,在体外5℃或25℃的结果几乎都完全与5℃冷藏时蚕卵的滞育发育时间曲线重叠。盐酸处理蚕卵酯酶A4的活性变化与蚕卵活化有高度相关性。     

二化性家蚕滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶活性的变化

二化性家蚕卵以25℃和15℃催青,可分别诱导成虫产下子代滞育和非滞育卵,而即时浸酸和5℃左右的低温处理可以分别阻止和解除胚胎滞育。利用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)显色法测定了经上述处理后的胚胎滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的活性,结果表明:胚胎发育后期的蚕卵经25℃催青,卵中的GST活性显著高于15℃催青蚕卵;蚕卵即时浸酸未显著改变胚胎滞育发动阶段蚕卵中的GST活性;5℃低温处理显著提高了滞育卵中的GST活性,但是未能显著改变即时浸酸卵的GST活性。上述结果表明,蚕卵中的GST活性变化与二化性家蚕胚胎滞育诱导和解除密切相关。     

低温处理对家蚕滞育卵还原型与氧化型谷胱甘肽比值的影响

还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值反映出细胞的氧化胁迫状况。利用分光光度法分别测定家蚕滞育卵持续25℃保护和经5℃低温处理后卵内谷胱甘肽代谢的变化,探讨蚕卵的谷胱甘肽代谢与滞育解除的关系。与持续25℃滞育温度条件下的蚕卵相比,5℃低温解除滞育的处理显著提高了蚕卵总谷胱甘肽含量、GSSG含量和硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性,而显著降低了GSH含量以及GSH/GSSG比值。结果表明,低温处理过程中,滞育卵TPX活性显著升高,间接地促进GSH氧化为GSSG,使GSH/GSSG比值显著下降,由此导致蚕卵处于过氧化状态。     

不冷藏或短期冷藏家蚕滞育卵的随时孵化技术研究

研究了家蚕卵产后经过 1～ 7d、10～ 2 0d解除滞育的孵化条件。蚕卵产下后在 2 5℃保护 1～ 7d的未完全滞育卵 ,用 1 0 75kg/L盐酸 ,4 6℃液温分别浸渍 5、10、2 0、2 5、4 0、4 5、5 0、70min ,实用孵化率可以达到 90 %左右。当蚕卵产下后在 2 5℃保护经过 10～ 2 0d时 ,用高温冲击加浸酸的方法可以解除其滞育 ,实用孵化率可达 90 %左右。     

家蚕滞育卵冷藏随时孵化法的研究

家蚕卵滞育后入库冷藏,若还未解除滞育前,难以中途出库应用于生产,使蚕种利用受到很大的限制。近年来我们进行了家蚕滞育卵冷藏随时孵化法的研究。结果表明:采用二段高温人工孵化法可使滞育卵入库冷藏后10—60天随时出库利用,其实用孵化率均达90％以上,对幼虫的体质和茧质不但无不良影响,而且有提高的倾向。     

适于滞育期蚕卵的基因组DNA提取方法

家蚕以卵滞育,蚕卵保存时间长,取样方便,但是DNA含量较低,抽提较为困难,利用不多。从处于滞育期(丙2胚子前)的蚕卵中快速高效地获取基因组DNA,对于提高家蚕研究效率具有实用价值。本试验对两种SDS法和一种CTAB法的抽提效果进行比较,结果表明SDS-II提取效果较好,单粒蚕卵提取基因组DNA即可用作PCR模板,5粒蚕卵获得DNA可以基本满足分子生物学研究需要。     

外源H_2O_2活化家蚕滞育性卵的研究

为进一步探讨H_2O_2与家蚕滞育的关系,研究了外源H_2O_2 活化家蚕滞育性卵的处理方法。发现H_2O_2 的浓度、处理时期和处理时间对活化效果有重要影响,提出了产于连纸的家蚕滞育性卵在产后2 4h(2 5℃)用6 %H_2O_2于4 7℃下处理30min可有效活化家蚕滞育性卵,孵化率达到96 % ;盐酸处理可有效活化经H_2O_2处理不能孵化的滞育性蚕种,表明盐酸和H_2O_2在活化家蚕滞育性卵上有协同作用。     

越年蚕种两段冷藏法的实用性探讨

本试验对家蚕滞育卵长期保存研究,探索出了越年种有效保存时间和两段不同的低温冷藏法。即:第一段用抑制发育的1℃低温,保存滞育期的滞育卵;第二段在用种前的一段时间,用促进解除滞育的5℃低温冷藏,促进蚕卵解除滞育后即可出库使用。1992年涪陵地区蚕种冷库用这种两段冷藏新法保存越年毛种23,868张,到1993年秋季,实用于农村大面积生产的散卵15,217盒,结果表明与当年春季生产的冷藏浸酸秋用种无明显差异,同样可以获得丰收。     

体外盐酸处理与PIN对酯酶A4活性影响的关系

从家蚕Ｃ１０８ 品种产下后２ｄ 的滞育性卵纯化酯酶Ａ４ 及其活性抑制多肽ＰＩＮ，体外调查了盐酸处理与ＰＩＮ 对酯酶Ａ４ 的ＡＴＰａｓｅ 活性影响的关系。结果表明：盐酸处理不仅迅速消除了ＰＩＮ 对酯酶Ａ４ 的ＡＴＰａｓｅ 活性抑制作用；盐酸处理使蚕卵酯酶Ａ４ 的ＡＴＰａｓｅ 活性峰提早出现的时间还反映了蚕卵的滞育发育时间。     

家蚕滞育卵对盐酸的反应性研究

在25℃保护时间短、尚未完全进入滞育的蚕卵,用一般即时浸酸方法处理,即可使2天孵化率达到90％以上。但保护时间长、完全进入滞育的蚕卵,低浸酸强度下,滞育解除率少,且有一部分已解除滞育卵蚁蚕不能破壳孵化而死亡;高浸酸强度下,一部分已解除滞育的胚胎不能发育到成熟就死亡;加上来自不同母蛾的蚕卵对盐酸的敏感性不尽相同;因此,用一般的浸酸方法处理,难以达到实用孵化的目的。本研究通过特殊浸酸方法,可使在25℃下保护15天和10天、5℃低温冷藏0至50天不等的滞育卵的2天孵化率接近或达到90％。