三疣梭子蟹Apaf-1基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析

本研究利用RACE方法克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)基因,该基因cDNA全长为2032 bp,其中,ORF为1050 bp,编码349个氨基酸,预测分子量为39.13 kDa,理论等电点为7.67。同源性和系统发育分析显示,Apaf-1与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) Apaf-1的同源性最高,为51.27%,并与凡纳滨对虾聚为一支。组织表达分析显示,Apaf-1基因的相对表达水平在肝胰脏最高,其次是肌肉、心脏、鳃和眼柄,血细胞和表皮最低。不同盐度胁迫后,Apaf-1在Ⅱ期幼蟹体内表达水平在3 h达到最大值,此后,呈先下降再上升趋势;Apaf-1在80日龄盐度20胁迫后三疣梭子蟹的鳃中呈上升趋势,在肝胰腺中为先上升后下降趋势,表明盐度改变能影响该基因在鳃和肝胰腺组织中的表达。不同病原感染实验结果显示,在血细胞中,注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后Apaf-1的表达于48 h到达峰值,为对照组的2.76倍(P<0.05),注射白斑综合征病毒(WSSV)后,仅在12 h表达水平上调,为对照组的1.25倍(P<0.05);在肝胰腺中,注射副溶血弧菌后在72 h到达峰值,为对照组的5.44倍(P<0.05),注射WSSV后在12 h到达峰值,为对照组的5.89倍(P<0.05),整体呈上调表达趋势。本研究为进一步理解三疣梭子蟹Apaf-1基因的生理功能提供了参考。     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp,包括4832 bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15 kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,Pt DNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12 h (4倍),随后逐步下降,在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后Pt DNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp,包括4832 bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15 kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,PtDNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12 h (4倍),随后逐步下降,在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后PtDNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24 h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。     

三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低盐胁迫中的表达特征分析

采用RACE技术克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)TLRs家族的一个新基因,将其命名为Pt Toll4。该基因c DNA全长为4276 bp,5?和3?非编码区分别为339 bp和1252 bp,编码一个含有895个氨基酸、分子量为102.5 k Da、理论等电点为6.03的蛋白质。Pt Toll4蛋白是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRRCT结构域及保守的胞内区TIR结构域。同源性及系统进化分析显示,Pt Toll4氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)Es Toll2的同源性最高,为61%。实时荧光定量PCR结果显示,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低。利用副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和对虾白斑综合征病毒(WSSV)对三疣梭子蟹进行注射感染,结果显示,经WSSV感染后,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量显著提高,在6 h时出现峰值,为对照组的5.03倍(P0.01)。经副溶血弧菌感染后,Pt Toll4基因仅在48 h略微出现上调,其余时间点与对照组无显著差异。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹应答WSSV的免疫过程中发挥了重要功能。此外发现,低盐胁迫显著抑制了Pt Toll4基因在三疣梭子蟹血细胞中的表达,这可能是导致低盐环境下三疣梭子蟹等甲壳类动物免疫力下降的原因之一。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹先天免疫过程中发挥了重要功能,本研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理研究提供了数据支持。     

盐度胁迫下三疣梭子蟹Ferritin基因的原核表达

为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性, 利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因, 将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中, 转化大肠杆菌DE3(BL21), 并进行IPTG诱导表达。结果表明: 经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现, 与预期的理论值(19.448 kD)相符合; 高盐胁迫下, 转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P< 0.001), 并且随盐度升高, 两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力, 由此推测Ferritin基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。本研究旨在为生产过程中三疣梭子蟹养殖水体的盐度调控策略提供理论依据。

     

低盐胁迫下三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因的表达

本研究采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)蝗抗利尿肽(neuroparsin,PtNP)基因。该基因全长1920 bp,5￠端非编码区237 bp,3￠端非编码区1373 bp,开放阅读框309 bp,编码102个氨基酸,预测分子量10.8 k D,理论等电点7.42。PtNP含有12个半胱氨酸残基,具十足目动物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系统进化分析表明,PtNP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NP4的同源性最高(89%),并且三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支。组织表达分析发现,PtNP基因在脑组织中的相对表达量最高,其次是鳃和眼柄,在卵巢、肌肉、心脏和肝胰腺中表达量较低或不表达。通过分析PtNP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐胁迫可显著改变PtNP基因在脑、鳃和眼柄组织中的表达模式,整体呈现上调表达趋势,其中在脑、鳃和眼柄中表达量分别最高上调至7.7倍、2.8倍和2.6倍,且存在显著差异(P0.05)。去除眼柄后该基因在鳃中的表达呈上升趋势,且去除双侧眼柄组的表达量显著高于去除单侧眼柄组(P0.05)。本研究结果表明PtNP基因在三疣梭子蟹盐度适应中可能发挥一定作用且受神经内分泌系统的调控。     

杂色鲍14-3-3ζ基因的克隆及其在应激下的表达

酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白ζ(14-3-3ζ蛋白)是14-3-3蛋白家族的亚型之一。14-3-3蛋白是一种高度保守的酸性可溶性蛋白,它可以与激酶、磷酸酶等多种信号蛋白结合,并在信号转导和细胞凋亡等过程中发挥相应的作用。本实验通过SMART-RACE技术首次获得了杂色鲍14-3-3ζ基因的全长,并命名为Hd14-3-3ζ,其cDNA全长为3 010 bp,ORF为819 bp,共编码272个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示,Hd14-3-3ζ基因在杂色鲍各组织中均有表达,其中在肝胰腺和血细胞中的表达量相对较高。当处于缺氧环境下时,鳃组织中Hd14-3-3ζ的表达在4 h时存在显著差异,血细胞中Hd14-3-3ζ在24 h和96 h时表达量显著上调。高温应激下,Hd14-3-3ζ在血细胞中的表达量无显著变化,而鳃组织中Hd14-3-3ζ在96 h的表达量却显著上调。高温缺氧联合应激实验表明,鳃组织中Hd14-3-3ζ在4 h、24 h和96 h均显著上调,而血细胞中的表达量没有显著性变化。经检测发现,副溶血弧菌注射后,鳃组织中Hd14-3-3ζ在3 h和24 h,血细胞中在6 h和24 h的表达量显著上调。以上温度、溶氧量等环境因素以及病原菌的刺激均会导致Hd14-3-3ζ在不同组织中表达量的显著变化,说明Hd14-3-3ζ在杂色鲍的免疫反应中可能扮演着重要的角色。     

三疣梭子蟹蜕皮激素受体EcR基因的cDNA克隆及表达分析

通过简并引物扩增及Smart TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹Portunus trituberculatus蜕皮激素受体EcR基因cDNA全长序列。该基因全长2 996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点pI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,EcR基因的表达量在24h后显著低于对照组(P0.05),总体呈下降趋势;低盐(11)胁迫条件下,EcR转录组的表达量呈现先降低后上升的趋势,在12h达到最低,之后逐渐上升,在48h之后显著高于对照组(P0.05)。     

三疣梭子蟹Sox基因HMG盒的克隆分析

利用能扩增人类SRY基因HMG盒的一对简并引物,分别对三疣梭子蟹雌雄个体基因组DNA进行扩增,均得到216 bp和约400 bp的两条带,不存在性别差异,通过PCR-SSCP分析,未发现雌蟹或雄蟹所特有的Sox基因。对216 bp的带进行克隆测序得到6个Sox基因,分别命名为PTSox21、PTSox12、PTSox11a、PTSox11b、PTSox11c和PTSox4。其中,PTSox21、PTSox12和PTSox4氨基酸序列与人类Sox21、Sox12和Sox4基因的同源性分别为90%、66%和63%,PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c氨基酸序列均与人类Sox11基因有63%的同源性。此外,PTSox11a和PTSox11b的氨基酸序列之间的同源性达到了98.6%,只在第44位氨基酸残基不同。与其他物种Sox基因氨基酸序列的同源性比较发现,PTSox21与饰纹姬蛙Sox2a有92%的同源性,而PTSox12、PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c均与意大利蜜蜂的Sox1有73%的同源性,PTSox4与意大利蜜蜂的Sox1有72%的同源性。     

三疣梭子蟹核受体基因HR38的克隆及其在蜕皮中的表达分析

采用RACE技术,克隆出三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)核受体基因HR38的c DNA全长,命名为PTHR38。该基因c DNA序列全长为2950 bp,5′和3′非编码区(UTR)长分别为101 bp和551 bp,开放阅读框(ORF)长2298 bp。推测编码765个氨基酸,预测分子量为84.2 k D,理论等电点为6.3。生物学分析预测,PTHR38基因编码的蛋白属于不稳定蛋白,不具有跨膜结构域。同源性分析表明,PTHR38基因编码的氨基酸序列与大型溞(Daphnia magna)的同源性最高。实时荧光定量分析表明,PTHR38基因在蜕皮周期的各个组织中均有差异表达,在眼柄中表达差异最大。去除单侧眼柄后,PTHR38的表达量在整体上呈现不同程度的上升趋势。     

脊尾白虾14-3-3 基因cDNA 全长的克隆和表达分析

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸组成的蛋白质,分子量为27.95 kD,理论等电点为4.65。同源性分析表明,脊尾白虾Ec14-3-3氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高,达到98%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec14-3-3基因在血细胞、卵巢、肝胰腺等组织中均有表达,其中血细胞中Ec14-3-3相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究结果表明,Ec14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中发挥重要作用。     

三疣梭子蟹细胞Cdk7基因克隆及其在卵巢发育中的表达

本实验应用RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)周期蛋白依赖性激酶7(Cdk7)基因c DNA序列全长。基因5′和3′非编码区域(UTR)以及开放阅读框的长度分别是23 bp、178 bp和1056 bp,预测编码一个含有351个氨基酸,分子量为39.91 k D的蛋白质,包含一个丝氨酸/苏氨酸催化保守结构域和T-loop结构。同源性分析表明,三疣梭子蟹CDK7氨基酸序列与其他物种Cdk7相似度较高,说明Cdk7基因具有很好的保守性。实时荧光定量PCR结果显示,三疣梭子蟹Cdk7基因在卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。Cdk7基因在卵巢发育不同时期的表达量存在差异,其在I期和Ⅱ期的表达量显著高于其他时期(P0.05)。去除眼柄后该基因在卵巢组织中的表达呈现先升高后降低的趋势,并于第4天达到最大值。本研究的结果表明,Cdk7基因参与了三疣梭子蟹卵巢发育调控,为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物性腺发育调控机理研究提供了重要信息。     

三疣梭子蟹FAMeT基因克隆及其在蜕皮周期中的表达水平

法尼酸甲基转移酶(farnesoic acid O-methyl transferase, FAMeT)是甲基法尼酯(methyl farnesoate, MF)生物合成途径中最后一步的关键酶,MF是一种类似昆虫保幼激素(juvenile hormone, JH)的倍半萜,在甲壳动物的生长发育及繁殖过程中起到了重要作用。本文克隆得到了三疣梭子蟹FAMeT的全长cDNA序列（GenBank登录号：KC192659）,它包括一个201bp 的5非编码区、一个318bp的 3非编码区,和一个825bp的开放阅读框（ORF）,编码274个氨基酸;推导的氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物FAMeT进行比对,发现一致性达75%-97%,其中与远海梭子蟹FAMeT的一致性最高;而且该氨基酸序列由两个CF（CPAMD8/FAMeT）区域组成,这两个CF区域是FAMeT的标志,在所有甲壳动物的FAMeT里均有发现,因此推导的氨基酸序列是三疣梭子蟹FAMeT基因。我们运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法分析了其在不同组织中、不同蜕皮周期中的表达量变化,发现FAMeT在三疣梭子蟹的各个组织里均有表达且在胸神经节(Taoracic ganglia)里表达最强;在三疣梭子蟹蜕皮过程中,大颚器FAMeT在D1期表达最强,然后逐渐下降至D4最低。该结果表明FAMeT在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要的作用。     

低盐胁迫对三疣梭子蟹鳃和肝胰腺显微结构及家系存活的影响

在实验生态条件下研究了低盐环境对三疣梭子蟹鳃丝和肝胰腺显微结构、家系存活率的影响。研究结果表明,低盐(15.0、13.0、11.0、9.0)胁迫能够诱导鳃丝和肝胰腺显微结构改变。盐度为15.0时,上皮层变薄,B细胞数量增多;盐度为13.0时,鳃丝不规则增厚,B细胞数量进一步增多,肝小管中的R细胞的数量减少,柱状上皮细胞的细胞质内出现许多空泡;盐度为11.0时,上皮层出现解体,鳃腔中的血细胞明显增多,肝细胞空泡化现象更为严重;盐度为9.0时,上皮层破坏直至解体,B细胞中转运泡数量增多,体积增大,细胞结构损伤严重。以72h的低盐半致死盐度(LD50=11.1)为评价指标,检测24、48、72h共计10个家系对低盐的耐受性。各家系对照组(盐度为35.0)在实验期间均未出现死亡现象,而在低盐胁迫条件下,随着时间的逐渐延长,各家系的存活率均呈下降趋势,24、48、72h的存活率变化范围分别在64.44%~80.00%、50.00%~68.89%和33.33%~60.00%之间。各家系72h时的存活率大小顺序为J10J4J9J5J7J3J6J2J8J1,均显著低于各自的对照组(P0.05)。     

三疣梭子蟹水通道蛋白 1 cDNA 及其盐度胁迫下的表达分析

采用RACE技术克隆获得总长为1 712 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白基因全长cDNA序列,命名为PtAQP基因.该基因5'和3'非编码区分别为153 bp和788 bp,开放阅读框为771 bp,推测编码256个氨基酸,预测分子量为27.0 kD,理论等电点为8.26.生物信息学分析表明,PtAQP含有6个跨膜区和2个NPA单元,具有与MIP家族匹配的保守氨基酸序列,属于稳定蛋白;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列与可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％),与可口美青蟹紧密聚为一支;荧光定量RT-PCR分析表明,PtAQP基因在各组织中均有表达,而在胃中的相对表达量最高.通过分析PtAQP基因在盐度胁迫中的表达规律发现,盐度胁迫可显著改变PtAQP基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.该研究结果表明,PtAQP基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用.     

三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。