口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建

采用分步扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因P1—2A、3C蛋白酶基因和3D聚合酶基因按正确的读码框依次连接克隆入pGEM-T载体。然后，将切取的目的基因亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle—CMV。构建成功的2个重组穿梭质粒经测序鉴定，含有完整的目的基因表达盒。穿梭质粒可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组，以产生重组腺病毒载体。     

同源异型盒基因的研究现状

Homeobox基因又名同源异型盒基因,它在整个动物王国的轴模式发育中起着核心作用.笔者综述了同源异型盒基因的功能、国内外研究进展及未来发展前景.     

家蚕同源异型结构域蛋白基因Bmvis的克隆及组织表达和亚细胞定位

同源异型结构域蛋白(homeobox,HOX)基因是对生物体的生长发育从时间和空间上进行调控的一类基因。Vis(vismay)属于同源异型结构域蛋白转化生长影响因子(transforming growth interacting factor,TGIF)家族成员,在脊椎动物的研究中表明TGIF是转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)信号转导途径中的转录抑制子,但在果蝇(Drosophilamelanogaster)的研究中发现其是一种转录激活子。基于为探究家蚕(Bombyx mori)中vis基因的功能提供基础信息的目的,在电子克隆的基础上通过RT-PCR从家蚕5龄幼虫精巢cDNA中克隆了长度为847 bp的vis基因(Bmvis)片段(GenBank登录号:JF412700)。蛋白结构分析表明Bmvis在HOX结构域的螺旋区和TALE区段内高度保守,同时在HOX结构域外的C末端大约20个氨基酸也是高度保守的。进化分析显示昆虫的Vis与Achi(achintya)聚为一类,但Vis与Achi根据物种分类关系聚在一起。对Bmvis在家蚕5龄第3天幼虫组织中表达的RT-PCR检测显示其仅在精巢中表达。将Bmvis进行原核表达后获得抗Bmvis多克隆抗体,亚细胞定位显示Bmvis在细胞核和细胞质中均有表达,但主要分布在细胞核中。     

紫花苜蓿MsHB1基因的克隆及表达分析

HD-Zip(Homologous structural Domain-leucine Zip,同源结构域-亮氨酸拉链)蛋白是植物特有的转录因子，其中HB1属于HD-ZIP I亚族。通过调节植物体内的内源激素含量变化，HB1转录因子可以提高植物对干旱、高盐等不利环境的抵抗能力。本文为探究紫花苜蓿HB1基因的生物学功能，采用RT-PCR技术成功克隆了MsHB1基因。其编码区长867 bp,编码288个氨基酸。氨基酸序列分析结果表明，HB1蛋白为不稳定蛋白。系统发育树分析表明HB1蛋白与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)同源蛋白的亲缘关系接近。构建MsHB1的原核表达载体，在大肠杆菌BL21中成功诱导紫花苜蓿MsHB1蛋白表达，Western Blot也证实MsHB1蛋白表达成功。表达分析显示：MsHB1基因在紫花苜蓿根、茎、叶中均有表达，在不同发育阶段中，幼嫩的叶片中表达最高。MsHB1在NaCl和ABA处理时的基因表达水平升高，推测MsHB1可能在紫花苜蓿高盐等胁迫应答方面发挥着重要的作用。     

HOX基因及其研究现状

Hox基因（Homeotic Complex Gene）,又称同源异型盒基因,是一类专门调控生物形体发育的基因,属于管家基因,主要是调控有关于细胞分裂、体轴、肢体和神经系统等部位的发育。一旦HOX基因发生突变,就会使身体的一部分变形,甚至致死。     

大鼠同源异型盒基因hex的克隆与序列分析

Hex基因作为同源异型盒基因超家族的成员,在造血细胞的分化和发育中发挥着重要的作用.为研究该基因在乳腺发育和分化中的作用,本研究采用RT-PCR方法扩增大鼠hex基因,并克隆到pMD18-T载体后测序.结果表明,大鼠的Hex基因读码框由816 bp组成,编码271 aa,分子质量为30 ku.与已发表的大鼠该基因序列完...     

赖草根茎分蘖相关基因LRC1的克隆及表达

运用同源基因克隆技术从典型的克隆植物赖草中克隆了其根茎分化相关基因LRC1,通过RACE获得其全长cDNA为1.598kb,开放阅读框(ORF)为1299bp,编码432个氨基酸.同源分析结果显示,赖草LRC1基因属于GRAS转录因子家族,与控制水稻分蘖及烟草侧枝发生的相应蛋白具有很高的同源性,与控制水稻分蘖的MOC1...     

紫花苜蓿MsMYB33基因克隆、亚细胞定位及转录自激活检测

MYB(V-myb Avian myeloblastosis viral Oncogene Homolog)转录因子数量较多、功能多样，在植物的发育过程中起着十分重要的作用。为了探究紫花苜蓿(Medicago sativa)中MsMYB33基因的亚细胞定位及自激活特性，本研究从紫花苜蓿中克隆MsMYB33基因，该基因开放阅读框为1 641 bp,编码多肽含有546个氨基酸。遗传进化树显示MsMYB33蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)中的CaMYB33蛋白同源关系最高。将MsMYB33与黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein, YFP)进行融合表达，结果显示：MsMYB33蛋白定位于细胞核。通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-MYB33酵母表达载体，并转化到Y2HGold酵母菌中。酵母自激活检测结果显示，MsMYB33具有自激活活性，进一步分析发现激活区域位于C端。本研究为进一步研究紫花苜蓿MsMYB33基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。     

一种快速稳定构建重组杆状病毒的方法

快速稳定地将外源基因插入杆状病毒基因组获得重组杆状病毒,是提高昆虫杆状病毒表达系统应用效率的关键技术之一。在Ac Bacmid的基础上,通过λRed同源重组技术敲除病毒基因组lef2和orf1629基因的3'端部分序列获得RDAc Bacmid-DualKo,并用Bsu36Ⅰ线性化之后,经重叠PCR获得5'端和3'端各含有50 bp同源臂及以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为外源基因的表达盒片段,再将线性化杆状病毒载体片段与表达盒片段共转染sf9细胞,3~4 d即可获得重组杆状病毒rvAcBacmid-GFP。SDS-PAGE和Western blot结果表明,被rvAcBacmid-GFP感染的sf9细胞能高效表达绿色荧光蛋白。该方法通过线性化复制缺陷型杆状病毒载体和携带有同源臂及外源基因的重叠PCR片段,在胞内完成同源重组获得重组杆状病毒,避免了繁琐的病毒空斑纯化和分子克隆操作,获得的重组杆状病毒中无不稳定因子BAC及影响下游应用研究的抗性基因,为快速构建重组杆状病毒高效表达外源基因及相关研究应用提供了新的技术平台。     

芒果 MADS-box基因保守区的克隆与序列分析

MADS-box 转录因子在多种植物的发育过程中发挥着重要作用。为从芒果中克隆新的 MADS-box基因,本研究利用MADS-box转录因子的保守特征设计简并引物,应用RT-PCR从芒果花序中成功分离出14 条MADS-box 基因cDNA 片段。片段长度在138~147bp之间,推导的氨基酸序列与已知的芒果MADS-box基因的同源性为65.2%~82.6%。用推导的氨基酸序列与已知的芒果和拟南芥 MADS- box基因进行系统发育分析,可将这些片段归入MADS-box 的不同亚家族中。表明芒果花序中存在多种 MADS-box 转录因子,可能参与芒果花器官的发育及开花时间的调节。 海南大学应用科技学院基金（HYK1402）     

NOBOX和FIGLA基因调控卵子发生的研究进展

卵母细胞所特有的转录调节因子在卵子发生、卵泡形成和胚胎发育的早期等多个阶段中具有重要作用。文章综述了在雌性生殖系中特异性表达的转录调节因子缺失生殖系α因子基因(factor in the germline alpha,FIGLA)和新生儿卵巢同源盒基因(newborn ovary homeobox Gene,NOBOX)在卵子发生过程中的研究进展,旨在为哺乳动物的生殖调控提供一定参考。     

鸡毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子的克隆、表达与虫体内定位

顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板，RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后，连接至pMD18-T载体，测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体，转化至表达菌BL21(DE3)，重组菌经测序鉴定后诱导表达，并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体，分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后，应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长1 830 bp，编码610个氨基酸，含有一个AP2结构域，预测分子质量67.69 ku；重组蛋白大小约为74 ku，主要以包涵体形式存在，可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别；在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白，分子质量约为85 ku；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内；第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因，证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内，为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。     

牛FSHR基因5′端侧翼序列的分析和多态性研究

以中国西门塔尔牛基因组DNA为模板，参照绵羊的FSHR基因序列设计和合成引物、PCR扩增获得长度为931bp，包括5′端侧翼797bp和结构基因第一外显子区134bp的牛FSHR基因片段，将该片段克隆于PUC18载体中，作序列分析发现：牛的FSHR基因转录启动子的遗传结构与人和鼠的FSHR基因不同，它的基因转录启动区含有TATA盒和类CAAT盒序列。在检索出的转录调节元件、或特征性序列位点，牛与绵羊在5个序列位点有碱基变异，这可能与牛和绵羊的产仔率高低不同相关，对34头份中国西门塔尔牛的扩增产物，应用PCR－RFLP方法进行多态性分析，TaqⅠ酶切出现了多态性，酶切产物电泳呈现3种基因型，由2种等位基因构成，通过对基因频率和基因型频率在种用公牛，双胎母牛和随机牛类群中分布的比较研究结果，认为该基因与牛的繁殖性状存在连锁相关。     

新城疫病毒F48E9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒（NDV）F48E9株融合蛋白（F）基因1700bp克隆到真核表达载体pcDNA3中，构建成表达F基因的载体pc3F。然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的3800bp DNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒（HVT）非必须片段载体pTK2B中，构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒体pTK3F。经限制性内切酶酶切分析，F基因表达盒的插入方向与pTK2B中TK基因转录方向一致。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的HVT重组病毒奠定了基础。     

紫花苜蓿ＷＲＫ转录因子基因的克隆与亚细胞定位

 ＷＲＫＹ 转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和ＲＴ－ＰＣＲ 结合的方法获得１个紫花苜蓿ＷＲＫＹ 转录因子家族成员的ｃＤＮＡ 序列,命名为MsWRKY56。该序列长１２６７ｂｐ,包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框,编码３１７个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

表达猪流感病毒血凝素基因的重组腺病毒的构建及免疫原性分析

通过细菌内同源重组的方法成功构建了表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素的重组腺病毒。首先将血凝素基因亚克隆到穿梭载体质粒pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP上，与腺病毒基因组质粒pAdeno Vator△E1／E3共转化大肠杆菌BJ5183菌株，经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd—HA—GFP。将该重组质粒转染293细胞以包装重组腺病毒。根据报告基因GFP的表达及Western-blot分析，证明获得了可正确表达猪流感病毒血凝素的重组腺病毒rAd—HA—GFP。重组腺病毒经一次性腹腔注射接种昆明鼠，2周后可检测到血凝抑制抗体，并且抗体至少可以持续12周，证实重组腺病毒介导表达的血凝素蛋白具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

BHV-1gG-／tk-／GM-CSF＋重组病毒的构建及其免疫效果的评价

通过引入免疫增强因子GM-CSF,提高重组病毒的免疫原性。将牛GM-CSF克隆到pcDNA3．1载体中,构建GM-CSF基因表达盒;将tk基因上游同源臂、GM-CSF基因表达盒、tk基因下游同源臂克到pcDNA3．1载体中,得到转移栽体pTK-GM-CSF。将亲本病毒BHV-1gG-／TK-／EGFP’基因组与转移载体pTK-GM-csF采用磷酸钙法共转染MDBK~g,得到重组病毒BHV-1gG／TK-／GM-csF’。并对重组病毒的生物学特性和对日本大耳白兔的免疫原性进行了评价。利用PCR和RT-PCR证实GM-CSF基因表达盒已正确插入重组病毒的tk基因位置,并具有转录活性。亲本株和重组株的空斑形态、空斑直径大小无明显差异;两者病毒滴度无明显变化．生长曲线相似;体外遗传稳定性良好。兔体试验表明,在免疫早期重组毒株能产生较亲本株更高水平的IFN-B（P〈0.05）。但中和抗体水平、攻毒后的临床症状及病毒排毒时间等各项指标检测表明,亲本株和重组毒株之间无明显差异。在免疫早期重组株刺激机体产生的IFN-p高于亲本株,具有-定的应用前景。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）全长S基因插入pAdTrack—CMV穿梭质粒中，形成的转移质粒pAdTrack—CMV／S线性化后，用pAdEasy^TM系统电转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠埃希氏菌BJ5183，经同源重组，构建了含有全S基因的重组腺病毒载体，经酶切充分暴露反向末端重复序列后，与脂质体混合转染AD-293细胞，成功获得了AD-S复制缺陷型腺病毒，经检测证实，AD-S稳定性好，安全性高。转录水平检测证实，S基因得到了转录；荧光检测发现，外源蛋白已得到表达。