中华蜜蜂蜂毒蛋白酶基因cDNA片段的克隆及序列分析

为从中华蜜蜂蜂毒中扩增蛋白酶(Protease)基因,根据意大利蜜蜂蜂毒蛋白酶基因(GenBank登录号NM_001011584)的保守区设计引物,从中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA,将从毒腺中扩增出的产物克隆到pGEM-T easy 载体上,导入大肠杆菌JM109,阳性克隆经双酶切鉴定后测序,将测序得到的中华蜜蜂蛋白酶基因与已知的意大利蜜蜂核苷酸序列比较,同源性为95.22%.氨基酸序列分别与意大利蜜蜂、玉米螟、胡蜂、冈比亚按蚊、棉铃象甲虫、埃及斑蚊、热带爪蟾、棕尾别麻蝇、广盐螯虾、亚马逊蝮蛇进行同源性比较,同源性分别为91.71%、46.70%、41.94%、41.21%、39.56%、38.38%、37.35%、36.17%、34.24%、28.49%.本试验首次成功从中华蜜蜂工蜂毒腺中扩增到长度为545 bp、编码蛋白酶的基因片段, 所得序列已提交GenBank,登录号为:EF547156,这为以后克隆该基因全长序列以及利用基因工程技术进行蜂毒产业化开发奠定一定的基础.     

北京鸭血管活性肠肽基因cDNA片断的克隆及序列分析

为从北京鸭胃肠道中扩增血管活性肠肽(VIP)基因,根据鸡VIP基因(GenBank登录号X80906),设计了一对简并引物,从北京鸭腺胃、十二指肠和空肠提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,将从腺胃、十二指肠和空肠中扩增出的产物克隆到pGEM-Teasy载体上,导入大肠杆菌JM109,阳性克隆经双酶切鉴定后测序,将测序结果与鸡和鹅(GenBank登录号为DQ023161)的VIP基因进行同源性比较。本试验扩增到的VIP基因与已知的鸡和鹅核苷酸序列比较,同源性分别为94.61%和94.42%,氨基酸序列同源性分别为93.75%和95.71%。本试验首次成功从北京鸭腺胃、十二指肠和空肠扩增到长度为240 bp、编码VIP的基因片断(已提交GenBank,登录号DQ200173)。     

中华蜜蜂王浆多肽Apisimin基因转录、克隆与表达研究

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂头部cDNA文库并进行了测序,从8568个表达序列标签(expression sequencetag,EST)中获得96个Apisimin基因克隆,结果表明Apisimin基因是一个高丰度转录的基因。进一步对克隆分析表明该基因cDNA全长为379 nt,包含一个237 nt、可以编码78个氨基酸的ORF。推导的Apisimin蛋白N端含有一个由24个氨基酸残基组成的信号肽,后端为54残基、预计分子量为5.9kDa的成熟肽。该ORF与意大利蜜蜂和印度蜜蜂的Apisimin基因核苷酸同源性分别为100%和95%。将成熟肽编码区进行亚克隆,构建了Apisimin与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX/apisimin,并将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达。SDS-PAGE和薄层扫描表明,表达的融合蛋白分子量为31 kDa,表达量占细菌总蛋白的22.1%,约50%是可溶性的。通过亲和柱进一步纯化了表达的融合蛋白。     

中华蜜蜂CREB基因的克隆及表达

【目的】克隆中华蜜蜂（Apis cerana cerana）的cAMP反应原件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB)基因全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,并解析中华蜜蜂CREB在大脑中的表达特征,为研究该基因在中华蜜蜂学习记忆过程中的生物学功能提供基础。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,解剖其大脑获得脑组织,提取大脑组织的总RNA。在此基础上,利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂大脑的CREB基因(AcCREB),然后用DNAstar软件中的Seqman程序将CREB正反向测序后的序列拼接获得CREB基因的cDNA序列,其氨基酸序列通过Bioedit软件按照六框翻译而成;用BLASTn和BLASTp进行序列比对分析;用ClustalX进行多重序列比对和同源性比较;用MEGA软件的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,明确其系统进化关系。并通过SMART数据库分析AcCREB的结构域。另外,将解剖好的蜜蜂大脑制成石蜡切片,并采用地高辛原位杂交技术分析AcCREB在中华蜜蜂大脑中的分布表达情况。【结果】中华蜜蜂CREB基因的cDNA全序列全长890 bp,编码240个氨基酸残基,序列提交到GenBank（登录号为KC814690）。其编码的蛋白预测分子质量为25.691 kD,等电点为5.82。结构域分析结果显示,该蛋白具有AA 89-131的PKID和AA 176-237的BRLA两个保守结构域。氨基酸序列比对结果显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂、印度跳蚁、家蚕、埃及伊蚊、疟原虫、人类、小鼠10个物种的同源蛋白相似度分别为98.76%、98.35%、97.11%、94.09%、72.22%、58.97%、44.69%、41.69%、36.89%、36.89%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与西方蜜蜂的CREB亲缘关系最近,与熊蜂、大黄蜂之间的亲缘关系次之。另外,经过地高辛原位杂交技术处理后,在中蜂大脑蘑菇体的凯尼恩细胞、触角叶周围的细胞和大脑的髓质与小叶之间的细胞均有阳性着色,而且AcCREB在中华蜜蜂工蜂左右大脑的阳性着色不对称。【结论】AcCREB的氨基酸序列与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂高度同源,且基因在大脑中的分布暗示其可能参与了中华蜜蜂学习记忆过程。     

中性β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建

利用RT-PCR方法从芽孢杆菌Bacillus Subtilis CY110中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α。测序结果表明,获得的目的基因片段大小为1 398 bp,该序列与Gen-Bank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQN01000006.1序列相比同源性达到99.8%,氨基酸序列同源性达到99.5%。将产物与pET-28 a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。     

中蜂与意蜂营养杂交对工蜂苹果酸脱氢酶Ⅱ的影响

本研究以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)为实验材料,进行中华蜜蜂与意大利蜜蜂营养杂交,然后应用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(IEF-PAGE)技术检测亲本和营养杂交后代的工蜂苹果酸脱氢酶Ⅱ的基因型、基因型频率、等位基因频率、杂合度和纯合度,结果表明:经过营养杂交后,杂交后代工蜂的苹果酸脱氢酶基因型发生了变化,并且苹果酸脱氢酶条带位置朝着对方蜂种偏移。     

吉林白鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

从吉林白鹅(Anser cygnoides)肝脏组织提取基因组DNA,应用Primer 5.0软件设计一对加入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的特异性引物,PCR扩增得到α干扰素基因(IFN-α),将PCR产物克隆至pMD18-T克隆载体,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性菌落进行鉴定和测序.结果表明,IFN-α已被成功克隆.序列分析结果显示该基因序列与GenBank中已知的狮头鹅(A.anser)lFN-α序列(登录号HQ009755)同源性为99.5％.     

里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析

文章以里氏木霉 (Trichoderma reesei)的基因组 DNA为模板 ,根据 Gen Bank上检索的 β-葡萄糖苷酶基因DNA序列 ,设计特异性引物 ,用高保真酶 probest polymerase进行 PCR扩增 ,获得了 2 .5 0 kb的 DNA片段。将其克隆在 p U C18的 Sma I位点上。测序结果表明 ,所获得的 DNA序列与 Gen Bank上检索的 β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列同源性达 99.90 % ,氨基酸序列同源性达 10 0 %。     

中华蜜蜂头部cDNA基因芯片制备与质量分析

通过对中华蜜蜂(Apis cerana cerana)头部cDNA文库测序和序列分析,获得8569条高质量EST序列.在功能注释的基础上,筛选出1025条基因芯片候选EST,并建立数据库.根据EST编号从文库选出相应的克隆,抽提质粒作为模板,进行EST片段PCR扩增和电泳检测,获得717个有效EST探针,经纯化后点制成cDNA基因芯片.将该芯片与经荧光标记的中蜂和意蜂工蜂头部cDNA样品杂交,经图像扫描和散点图分析,结果显示杂交信号正常,为进一步研究挖掘蜜蜂功能基因奠定了基础.     

长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因PCR及序列分析

为了揭示长白山区中华蜜蜂种型的分子特点,选取其线粒体DNA(mtDNA)非编码区至COII基因段的序列为研究对象,设计并合成了一种理想的用于扩增中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段的引物对E2’/H2’,结果可以获得418bp有效的核酸序列;该序列上A+T含量占84.45%,而G+C的含量只有15.55%,序列里长白山区中华蜜蜂与意大利蜜蜂在核苷酸水平上的种间序列相似性为81.71%,并且序列具有丰富的限制性核酸内切酶的酶切位点,其中,52位上的MseI的酶切位点属于长白山区中华蜜蜂的特异酶切位点,53位处出现一个SNP位点,属于由碱基C转换为碱基T的转换型突变,这也进一步证明了蜜蜂mtDNA非编码区是进化速度较快的区域。长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段序列结果已经获得美国国家生物信息(NCBI)网站GenBank的登录号,登录号为FJ494922。     

黑龙江省野生中华蜜蜂调查报告

通过对镜泊湖周边、东宁和饶河地区黑龙江省野生中华蜜蜂(Apis cerana cerana)的调查、收捕及标本观察,结果表明:野生中蜂多分布在黑龙江省东部山区,栖息于活体树洞中。标本观察中蜂工蜂体色背板以几丁质黑色为主,腹板为黄色,东南部林区多有第二背板工蜂有黄色带,个体与南方中蜂相似。收捕观测树洞巢脾分布多以斜方向或横面对着巢门,呈圆柱状,气眼分布巢脾周围,饲料集中在巢脾上部,下部为繁殖区。     

中华蜜蜂群内工蜂监督研究

以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为实验材料,对处女蜂王分别进行单雄和双雄人工授精,并以自然交尾作为多雄交配对照。然后用标准的方法检测各蜂群对蜂王产的未受精卵(QUG)和工蜂产的未受精卵(WUG)的监督效果,结果表明:在自然交尾、双雄授精或单雄授精3种蜂群中,都明显存在工蜂监督现象。     

RNAi介导的中华蜜蜂AcerOBP14触角电位反应

明确中华蜜蜂(Apis cerana cerana)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因在RNA干扰前后的触角电生理(Electroantennogram,EAG)反应,可为中蜂嗅觉识别机制的深入研究提供理论参考依据.在前期对中蜂气味结合蛋白AcerOBP14基因序列、荧光竞争气味结合能力分析的基础上,试验进一步采用饲喂法对中蜂采集蜂AcerOBP14基因沉默后,进行qRT-PCR及EAG试验,筛选出对AcerOBP14有效干扰的序列,并比较干扰前后触角对不同气味物质EAG反应能力的变化.结果 表明,合成的2个不同片段大小的dsRNA均能够在不同程度上降低AcerOBP14 mRNA表达水平,dsAcerOBP14-1在饲喂48 h时沉默效果最好,沉默效率为68.9％.与只饲喂30％糖水的对照组相比,饲喂dsAcerOBP14-1的采集蜂触角对2-庚酮、α-法尼烯、β-罗勒烯和柠檬醛的EAG反应值极显著降低,对橙花醇和胡椒酮的EAG反应值显著降低.通过RNA干扰能够显著抑制AcerOBP14的表达,显著降低触角对报警信息素、植物花香挥发物、那氏信息素及幼虫信息素物质的电生理反应值.推测Ac-erOBP14是一种广谱结合蛋白,可能参与工蜂的采集及蜂群的秩序维持行为.     

江西省中华蜜蜂形态差异分析

为探究江西省中华蜜蜂的形态差异,采用逐步判别与聚类分析联用的方法对江西省11个样点330只中华蜜蜂工蜂样本的32个形态遗传标记数据进行了分析。结果表明,江西省中华蜜蜂在南、北区域出现明显的形态差异,赣中北地区较赣南地区的中华蜜蜂个体和器官偏大。本研究可为江西省中华蜜蜂资源的保护与利用提供参考。     

电穿孔作用将外源基因导入中华蜜蜂卵的研究

将中华蜜蜂卵与带有绿色荧光蛋白基因的质粒DNA混合,经电穿孔作用后,人工孵化蜜蜂卵,并对孵化的幼虫进行检测.结果筛选出一组较理想的中华蜜蜂卵电穿孔参数(750 V·cm-1,100 μs,1);通过荧光检测,电击卵孵化的幼虫体内可以表达EGFP基因,阳性表达率最高可达1.05%,且外源DNA转染早期卵的效率显著高于晚期卵.结果表明电穿孔作用成功地将外源基因引入中华蜜蜂卵内,质粒DNA转染中华蜜蜂卵的效率与卵的生长时期有关.     

长白山中华蜜蜂（Apis cerana cerana）遗传多样性分析

长白山中华蜜蜂是我国东北地区的重要蜜蜂资源,具有独特的分布区域、生物学特性和形态特性.本研究通过A107、AP043、AP085、AP313、AT101等5对微卫星引物与mtDNA tRNAku-COII 357 bp片段,对110只长白山中华蜜蜂进行遗传多样性研究.长白山中华蜜蜂在5个微卫星位点的平均期望杂合度、平均观察杂合度、平均香农指数分别为0.2110±0.2333、0.0645±0.0718、0.4031±0.4202,PIC值除A107为0.5541外,其它4个位点分别在0-0.1644之间;mtDNA标记检测到的单倍型多样度为0.249±0.054,核苷酸多样度为0.00074±0.00017,平均核苷酸差异为0.263,表现出很低的遗传多样性.长白山中华蜜蜂的遗传结构较为单一,5个微卫星位点的遗传结构均以一种等位基因为主,线粒体单倍型H1（Japan1）占83.64％,且在长白山中华蜜蜂研究中首次发现H3（登录号：KF673779）、H5（登录号：KF673782）、H7（登录号：KF673780）、H8（登录号：KF673781）等4种单倍型.长白山中华蜜蜂种群数量少,遗传多样性低,遗传结构单一,面临着灭绝的风险.长白山中华蜜蜂的资源保护刻不容缓,需要尽快建立保护区.     

中华蜜蜂Apidaecin的重组表达及其抗菌活性

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的重组表达,并验证纯化后的重组抗菌肽Apidaecin在体内和体外是否具有抗菌活性,为开发新型、安全具有抗菌和免疫调节功能的抗菌肽制剂提供理论依据。【方法】以意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）Apidaecin为模板,克隆出中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,成功构建his-pHT43/Apidaecin表达载体,并参照MoBiTec所提供的制备方法成功制得枯草芽孢杆菌感受态细胞,现配现用,以保证其活性并得以在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）进行表达蛋白的分离纯化,使用Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）试剂盒测定浓度。纯化得到的重组抗菌肽Apidaecin作用于大肠杆菌K88,在体外进行抑菌圈试验和最小浓度抑菌法测定;在体内,以小鼠为试验动物模型,试验组小鼠腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin,阴性对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组注射相同体积的头孢霉素,然后人为感染大肠杆菌K88,感染24 h后对小鼠进行解剖,取得肠道样品和血液样品,并从肠道屏障和免疫功能两个方面探讨重组抗菌肽Apidaecin对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用。使用ELISA试剂盒对染菌小鼠血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）与肠道sIgA水平进行测定,采用qRT-PCR法对小鼠肠道紧密连接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠肠道细胞因子（促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL6和抑炎因子IL10）的转录水平进行测定。【结果】克隆得到的中华蜜蜂Apidaecin含有183 bp的碱基,编码60个氨基酸,包含Apidaecin的信号肽序列、一个基础的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列（内含高度保守的8个氨基酸序列）,编码的蛋白质命名为AccApidaecin,其分子量为15.6 kD,等电点为5.33。在IPTG终浓度为3 mmol·L ^-1,诱导温度为30℃,诱导表达12 h后,可从1 L表达上清中纯化得到约20 mg抗菌肽。药敏试验显示,重组抗菌肽Apidaecin在体外与阴性对照相比有明显抑菌圈出现,且测得的最小抑菌浓度为10 mg·L ^-1;在小鼠体内,腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin的染菌试验组与注射生理盐水的染菌试验组相比免疫球蛋白含量差异显著(P<0.05),说明腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin能够有效缓解由大肠杆菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加;同时,小鼠肠道相关蛋白的基因表达量也差异显著(P<0.05),说明重组抗菌肽Apidaecin能够有效保护被大肠杆菌K88侵染的小鼠肠道。【结论】在枯草芽孢杆菌中能够成功重组表达中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,并且纯化后的中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin在体外对大肠杆菌K88有良好的抗菌效果;经腹腔注射进入小鼠体内,能够提高小鼠的免疫机能,有效抵抗大肠杆菌K88对小鼠的侵染。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1 177 bp,开放阅读框长1 050 bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6 kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究(英文)

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1177bp,开放阅读框长1050bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。