鸡白痢沙门菌pagC基因缺失株菌蜕疫苗的制备和免疫保护效果评价

为了在鸡白痢沙门菌pagC基因缺失突变株的基础上制备可用于鉴别诊断的菌蜕疫苗并评价其免疫保护效果,本研究利用细胞穿膜肽MAP制备ΔPagC菌蜕,透射电镜和荧光显微镜观察菌蜕形态和核酸残留情况;将ΔPagC菌蜕与佐剂ISA206混合乳化制备菌蜕疫苗并进行无菌检测;基于ICR小鼠评价菌蜕疫苗对鸡白痢沙门菌CVCC1800、肠炎沙门菌ATCC19585和鼠伤寒沙门菌CVCC542感染的交叉保护效果;结合基于PagC蛋白的沙门菌血清学检测方法评价pagC基因缺失株菌蜕疫苗的鉴别诊断效果。结果显示,菌蜕制备最佳条件为用终浓度为50μmol/L MAP溶液处理OD_{600 nm}=0.3的菌液1 h以上,灭活效果可达99.00%;菌蜕保持基本细胞形态的同时内容物大量释出,核酸残留水平较低;菌蜕疫苗针对上述3种血清型沙门菌的免疫保护率分别为25%、100%和100%;菌蜕疫苗与基于PagC蛋白的沙门菌血清学检测方法联用可在一定程度上起到鉴别诊断作用。结果表明,制备所得菌蜕疫苗在保护小鼠的同时,能够在一定程度上区分人工免疫和自然感染,为沙门菌的净化工作提供帮助。     

鸡白痢沙门菌研究进展

鸡白痢沙门菌是鸡白痢的病原,具有高度适应专一宿主的特点。它可引起雏鸡的急性全身性感染,发病率和病死率极高;成年鸡被感染后可引起体质量下降、产蛋率和孵化率降低、组织病变、白痢和生殖道畸形等,给很多国家的养鸡业带来巨大危害,并引起严重的经济损失。为了更好的预防和控制、甚至最终净化该病,需要对鸡白痢沙门菌进行深入的研究。本文从病原学及其基因组特征、流行病学、致病性及毒力基因、检测方法和防控措施等方面介绍了鸡白痢沙门菌的研究进展,并对其研究趋势进行了展望。     

鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌PCR-RFLP鉴别

根据鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌flic基因可变区两端的保守序列设计1对引物,PCR扩增出约866 bp的产物,用HinplI对PCR产物进行酶切,经RFLP分析区分鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌.利用该技术对1株鸡白痢沙门菌标准株及2株鸡伤寒沙门菌标准株进行分子鉴别,结果与预计的RFLP模式相符,证明该方法可行.在此基础上...     

鸡白痢沙门菌研究进展

本文就鸡白痢沙门菌的基因组学、与鸡伤寒沙门菌的鉴别方法、感染与致病机制、防治措施等方面的研究进展进行总结,以期为相关研究提供参考。     

鸡白痢沙门菌分离株的耐药性及磺胺类耐药机制研究

采用药敏纸片法,对33株鸡白痢沙门菌进行了药敏试验,结果显示丁胺卡那、卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、氟苯尼考的抑菌作用较强,所有受试菌株均对其敏感;58%～94%的受试菌株对氯霉素、新霉素、恩诺沙星和羧苄青霉素敏感;61%～88%的受试菌株对四环素、复方磺胺、磺胺异恶唑耐药。33株鸡白痢沙门菌分离株出现了多重耐药性,2耐及以上占85%,3耐及以上占66%,4耐及以上仅占27%。根据发表的序列设计了3对引物,分别扩增磺胺类耐药基因sul1、sul2和Ⅰ类整合子,所选的18个对磺胺及磺胺增效剂均耐药。分离株中94.4%(17/18)的菌株携带sul1基因,没有sul2基因,同时94.4%(17/18)的菌株携带Ⅰ类整合子,大小分别为0.7kb和1.6kb。研究表明这些鸡白痢沙门菌的耐药谱较窄,且Ⅰ类整合子在磺胺类耐药菌株的产生中起到很重要的作用。     

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术（SSH）对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析.结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段.经同源分析,这些序列可分为3类：噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列.这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素、IpaJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因.结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门茵Sg9株基因组问存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础.     

肉鸡鸡白痢沙门菌的分离鉴定

2009年5月,北京郊区某肉鸡养殖户的2 000只7日龄雏鸡出现拉白色稀粪,肝脏有黄色结节等症状和病变的疾病。为探索该病病因及制定有效防治措施,对病鸡样品进行了细菌学检验。通过细菌分离、生化试验、PCR及16 S rRNA基因测序鉴定出1株鸡白痢沙门菌。该分离株感染试验鸡能复制出与其临床表现一致的病例并能引起死亡。表明鸡白痢沙门菌是危害北京郊区该养殖户肉鸡的病原。     

鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用

分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带,鸡伤寒沙门菌显示417 bp和636 bp两个条带,而阴性对照未出现条带,与预期设计相符。双重PCR体系对56株不同血清型沙门菌鉴定结果与细菌学分离的血清型鉴定结果完全一致,说明本试验建立的双重PCR体系特异性良好,应用上述方法检测鸡场疑似20份临床样本,结果发现8株鸡白痢沙门菌阳性,1株鸡伤寒沙门菌阳性。上述结果表明,已建立双重PCR方法特异性检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。本试验为鸡白痢和鸡伤寒不同生物型沙门菌的检测提供了一种简洁、敏感、特异的新方法。     

鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的验证

为验证鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的准确性,本研究以3株鸡白痢、鸡伤寒沙门菌国际参考菌株和306株国内分离株为研究对象,采用5种已知的分子分型方法开展验证性实验。结果发现,基于特定基因可变区的2种分型方法具有良好的特异性,其检测结果与生化分型结果一致,而3种基于特定基因单核苷酸多态性的分型方法则出现假阳性或假阴性的结果。上述结果表明,鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的准确性仍需进一步验证。     

23味中药对鸡白痢沙门菌地方株体外抑菌试验

为了研究23种中药对鸡白痢沙门菌地方株S1、S2及标准株的体外抑菌试验效果。方法:利用平板琼脂打孔法和试管二倍梯度稀释法分别测定抑菌圈直径大小、最小抑菌浓度(MIC)。结果表明:鸡白痢沙门菌地方株S1、S2对黄芩、连翘、五倍子等8种药物极度敏感;对其他的药物存在不同程度的敏感性。本试验研究为鸡白痢沙门菌地方株中药防治提供理论基础。     

缺失rfaH基因的鸡白痢沙门氏菌株的构建及鉴定

为研制可以鉴别检测基因缺失型鸡白痢疫苗与自然感染菌,本研究通过基因同源重组技术,利用高效自杀性载体系统,敲除鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)CVCC 79201株的rfaH基因,同时未引入任何抗生素抗性基因等外源DNA序列,经筛选获得重组S.pullorum(rSp)株。检测结果显示缺失菌由光滑型转变为粗糙型。rSp在普通琼脂培养基上传15代后,仍然保持粗糙型表型。动物试验结果表明,rSp免疫伊莎褐蛋鸡后,其抗血清可通过平板凝集试验与CVCC 79201免疫的血清相区分。本研究为S.pullorum缺失疫苗的研制提供了技术平台。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。     

肠炎沙门菌非编码小RNA isrC基因缺失株的致病性

细菌非编码小RNA(sRNA)是一类可在转录后水平调控基因表达的调节子。IsrC是存在于鼠伤寒沙门菌毒力岛上的一种与毒力相关的sRNA,可调节巨噬细胞存活蛋白MsgA的表达。本研究克隆了肠炎沙门菌50336菌株isrC基因,通过λ-Red同源重组系统构建了isrC缺失突变株50336△isrC,并利用表达载体pBR322构建了回补株50336△isrC/pisrC。将野生株,isrC突变株和回补株分别接种1日龄清远麻鸡,比较三者之间的致病性差异。结果显示,肠炎沙门菌isrC基因与鼠伤寒沙门菌同源性为100%;成功构建了isrC缺失突变株和回补株;野生株,突变株和回补株对雏鸡的半数致死量(LD50)分别为2.81×108 CFU,2.02×108 CFU和3.10×108 CFU,相比野生株50336,突变株50336△isrC的LD50明显下降,表明isrC基因的缺失增强了肠炎沙门菌的毒力。     

肠出血性大肠杆菌O157 ler基因缺失突变株的构建及其特性

以肠出血性大肠杆菌O157∶H786～24为始发菌株,利用自杀性载体pCVD442,根据同源重组的原理敲除了染色体上的ler基因,构建了O157∶H7 ler基因缺失突变菌株,并对其生物学特性进行了初步研究。荧光定量PCR试验结果表明,始发菌株对HEp-2细胞的平均黏附数量是突变菌株的17倍。试验也证实了ler基因对LEE致病岛毒力基因的正调控作用,这为O157∶H7基因缺失突变弱毒疫苗株的建立奠定了基础。     

肠炎沙门菌mreB基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究

MreB蛋白广泛存在于原核生物中,主要生物功能是聚合形成类似于肌动蛋白微丝的纤维,参与细胞形状的维持。为研究肠炎沙门菌的mreB基因缺失对环境压力的应激变化,本研究利用Red重组方法构建肠炎沙门菌SM6株的mreB基因缺失株,同时构建其回补菌株,观察缺失株SM6ΔmreB的形态学变化,分析其对温度缺氧应力、渗透应力以及耐酸性的变化。结果显示,缺失株SM6ΔmreB的菌体变为球状,生长受到抑制;SM6ΔmreB对升温缺氧压力的耐受能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05);在渗透压条件为100mmol/L和200mmol/LNaCl时缺失株的生存能力明显弱于亲本株和回补株(p<0.05);缺失株在强酸环境中的生存能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05),而对中性和弱酸性环境的适应能力与亲本株相似。本研究为进一步探究MreB蛋白在沙门菌的致病机制以及菌蜕形成过程中的作用奠定了基础。     

貉肠炎沙门菌htra基因缺失株的构建及生物学特性

为研究HtrA蛋白对貉源肠炎沙门菌毒力和生物学特性的影响,本试验利用Red同源重组方法对HtrA蛋白编码基因htra进行敲除,并从生长特性、生化特性、耐pH应激与氧化应激、抗血清杀伤和菌株毒力等方面对突变菌株进行评价,结果显示:与野生型菌株相比,htra基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其对酸性和碱性环境的敏感性增加,对血清的耐受力下降,动物实验结果显示htra基因缺失后肠炎沙门菌对小鼠半数致死量有显著提高。本试验成功构建貉肠炎沙门菌htra基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。     

华东地区鸡白痢沙门氏菌毒力基因的分子流行病学调查

为了解鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)的相关毒力因子的流行病学变化,本研究参考GenBank中相关基因序列设计引物,对2010年10月至2012年7月期间江苏、安徽、上海、浙江等华东地区鸡、鸭、鹅、鸽中所分离的70株S.pullorum的毒力岛SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5的毒力基因hilA、sseL、mgtC、siiE、sopB 进行PCR检测,并选择10株分别来源于鸡、鸭、鹅、鸽源的的分离株进行测序分析.结果显示70株S.pullorum均携带5个毒力基因,位于SPI-1、SPI-2及SPI-3的hilA、sseL、mgtC基因高度保守(100％),而位于SPI-4、SPI-5的siiE和sopB基因在个别位点出现突变.本研究为S.pullorum毒力基因在流行菌株中的分布及变化情况提供实验依据.