绵羊源十二指肠贾第虫和隐孢子虫的分子鉴定

为了解河南省安阳市绵羊源贾第虫和隐孢子虫的分子特性,对基于卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖溶液漂浮法检查获得的16份绵羊源贾第虫和3份隐孢子虫分离株分别进行DNA提取,并基于16S rRNA基因位点和18S rRNA基因位点进行巢式PCR扩增,获得阳性扩增产物,再进行测序鉴定和系统发育进化分析。结果显示,PCR成功扩增绵羊源贾第虫和隐孢子虫的特异性基因位点。基于对上述2种肠道原虫特异性基因位点的分子序列分析,将贾第虫鉴定为十二指肠贾第虫集聚体E(93.75%,15/16)和集聚体A(6.25%,1/16);将隐孢子虫鉴定为泛在隐孢子虫（66.67%,2/3）和猪隐孢子虫（33.33%,1/3）。     

动物园圈养大熊猫毕氏肠微孢子虫分子流行病学调查

为了解各地动物园圈养大熊猫的毕氏肠微孢子虫感染情况及其人畜共患风险,采用基于ITS基因的巢氏PCR方法,对江苏、福建、浙江等10个省(市、自治区)的动物园圈养大熊猫毕氏肠微孢子虫的感染情况及基因分型进行调查和检测。在31份大熊猫粪便样品中,共检测到毕氏肠微孢子虫阳性14份,总感染率45.2%,检测出SC02(13/14)和Peru6(1/14)两种毕氏肠微孢子虫基因型。种系发育分析表明,SC02和Peru6都属于具有人畜共患潜能的group 1b。本实验首次发现SC02基因型毕氏肠微孢子虫感染大熊猫,表明大熊猫可能作为毕氏肠微孢子虫的储存宿主引起人微孢子虫病,拓宽了基因型SC02的毕氏肠微孢子虫宿主范围。     

云南地区猪毕氏微孢子虫的分子检测及其基因型鉴定

[目的]从寄生虫角度明确猪场发生猪腹泻的主要病原体,为防控云南规模化猪场毕氏微孢子虫感染提供理论依据.[方法]通过巢式PCR对云南玉溪和保山地区4个猪场的129份猪粪样本进行猪毕氏微孢子虫检测,扩增微孢子虫的ITS序列,经测序分析和构建系统发育进化树确定其基因型.[结果]129份猪粪样中有30份感染毕氏微孢子虫,感染率为23.26%;其中,云南保山地区的猪毕氏微孢子虫感染率为56.82%(25/44),玉溪地区的感染率为5.88%(5/85),二者差异极显著(P<0.01,下同).按不同发育阶段划分,发现以仔猪的毕氏微孢子虫感染率最高(76.92%),成年猪的感染率相对较低(11.39%),感染率在不同发育阶段间差异极显著.经测序分析发现共有6个基因型,包括5个已知基因型[CHC5(n=3)、CHG19(n=7)、EbpD(n=9)、EbpA(n=2)和EbpC(n=4)],1个新的基因型YNZ1(n=5);从基于微孢子虫ITS序列同源性构建的系统发育进化树可知,检测出的6种基因型均属于Group 1,即具有人兽共患的可能性.[结论]云南猪场普遍存在毕氏微孢子虫感染,且均属于具有人兽共患可能性的基因型.因此,要重点加强猪场微孢子虫的防控工作,养殖过程中产生的粪便等养殖污染物必须经过堆肥发酵或消毒处理后才能作为农家肥使用或排入污水中.     

安氏隐孢子虫ITS-1基因PCR检测方法的建立

[目的]建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑.[方法]根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性.[结果]基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上.敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%.[结论]安氏隐孢子虫ITS-i基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析.     

郑州市山羊隐孢子虫感染情况调查与分析

为了对郑州市山羊隐孢子虫感染情况进行初步了解并分析虫株的种类和遗传进化关系,应用饱和蔗糖漂浮法对郑州市不同县市采集的276份山羊粪便样品进行山羊隐孢子虫感染情况检测,并应用PCR扩增部分阳性样品的核糖体18S rRNA基因序列,对获得的基因序列进行分析,确定所获得的隐孢子虫分离株的种类和遗传进化关系。结果表明,郑州市山羊隐孢子虫感染率为3.26%。序列比对和遗传进化分析表明,获得的9个山羊隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因序列同源性为97.4%～99.9%,与已知牛隐孢子虫(Cryptosporidium bovis)分离株的同源性超过98.8%,且分离株与牛隐孢子虫属于同一大分支,与其他虫株所属分支相隔较远,表明获得的9个山羊隐孢子虫分离株均为牛隐孢子虫。综上,郑州市存在山羊隐孢子虫病的流行情况,均为牛隐孢子虫感染,会对人畜健康造成较大的威胁,亟须制定并实施相应的防控措施。     

应用巢式PCR-RFLP方法鉴别我国常见的几种隐孢子虫

应用巢式聚合酶链反应(Nested PcR)-限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)、贝氏隐孢子虫(C.baileyi)和猪隐孢子虫(C.s...     

广西融安某猪场感染隐孢子虫的情况调查

为掌握广西壮族自治区是否存在猪隐孢子虫病,为该病的防治提供科学依据。本文通过采用饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法对广西融安某猪场进行隐孢子虫调查。结果显示,164份样品,阳性样品数为10份,阳性率6.0%;其中1~2月龄的40份样品中有9份阳性,阳性率25.0%;2~3月龄的只有1份阳性,阳性率2.0%;其他组别并没发现有阳性。证实该猪场存在隐孢子虫,这也是在广西地区首次报道猪感染隐孢子虫。     

宠物豚鼠隐孢子虫感染情况调查及其虫种鉴定

为了解宠物豚鼠隐孢子虫感染情况,用饱和蔗糖溶液漂浮法对郑州某宠物市场55份豚鼠粪便和免疫抑制后的30只豚鼠新鲜粪便样本进行检查。结果发现,隐孢子虫总感染率分别为12.7%和80%,卵囊呈近圆形,卵囊大小为5.3μm×4.7μm〔(5.0～5.5)μm×(4.4～4.9)μm〕,卵囊指数为1.11。基于18SrRNA基因位点,对调查中发现的7个隐孢子虫分离株进行PCR扩增,PCR-RFLP和测序结果显示,7个分离株均为维瑞隐孢子虫。宠物豚鼠隐孢子虫感染较为普遍,感染虫种是维瑞隐孢子虫,且豚鼠在免疫抑制后,其隐孢子虫感染率显著增高。     

河南省畜禽隐孢子虫病流行病学调查

作者对河南省郑州市开封市及信阳地区牛群、鸭群和鸡群的隐孢子虫病流行情况进行了流行病学调查结果表明:郑州市郊奶牛隐孢子虫感染的平均感染率为40%,随着牛的年龄增大,感染率有呈下降的趋势。经鉴定,郑州市郊奶牛场的隐孢子虫为小鼠隐孢子虫。郑州市开封市及信阳地区家鸭的群体隐孢子虫感染率为69.57%,1～8月龄感染率(87.5%)明显高于8月龄以上鸭的感染率(60%).阳性鸭群粪中卵囊数均较少.郑州市郊8个猪场的粪样中有7个猪场粪样呈阳性.粪样的平均阳性率为17.7%,郑州猪场的隐孢子虫亦为小鼠隐孢子虫.郑州地区12个鸡扬中没有发现隐孢子虫感染。     

牛源环孢子虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

 【目的】 建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列，设计1对保守引物和1对特异性引物，建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件，进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段，与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应；最低能检测到2.85×10-2 fg的阳性参照DNA；对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性，有较好的临床应用价值。     

安徽省奶牛隐孢子虫病流行病学调查

为了查明安徽省奶牛隐孢子虫感染与地理分布情况，选取该省境内4个奶牛场进行了奶牛隐孢子虫感染情况的调查，结果在26头奶牛的粪样中查到了隐孢子虫卵囊，其感染率为5．18％（26／502）。经鉴定，所获虫体为鼠隐孢子虫（Cryptosporidium muris）和小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）。     

隐孢子虫病的诊断与防治措施

隐孢子虫病可引起人与脊椎动物呕吐、腹泻、脱水等临床症状,没有物种特异性,不同阶段的脊椎动物均可被感染,但年龄越小,感染后发病率越高,威胁着人类及牲畜健康,同时也可造成较大的经济损失。目前对隐孢子虫引发的隐孢子虫病还没有有效的治疗方法。该文主要从隐孢子虫病原体的特征、流行病学、发病机制、临床症状、诊断方法及防治措施6个方面对隐孢子虫进行综述,以期为隐孢子虫引发的各种疾病的综合防治提供理论参考。     

东方蜜蜂微孢子虫20s PS基因的分子克隆与生物信息学分析

为解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的20s 蛋白酶体亚基（20s proteinsome submit, 20s PS）基因20s PS的分子特性，鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的20s PS蛋白的保守基序和结构域并进行系统进化分析，通过常规PCR扩增20s PS的CDS区并进行TA克隆。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析20s PS的理化性质、跨膜螺旋域、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。采用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种20s PS的保守基序。利用TBtools软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种20s PS的结构域。使用Mega 11.0软件构建东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的20s PS的系统进化树。成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫20s PS的CDS区，20s PS在孢子中真实表达。20s PS基因含有618个核苷酸，可编码205个氨基酸；20s PS蛋白的分子式为C₁₀₂₂H₁₅₈₂N₂₆₀O₃₁₆S₁₂，分子量约为22.95 kDa，脂溶系数为78.93，等电点为5.00，平均亲水系数为-0.157；不含跨膜螺旋域和典型信号肽；包含14个丝氨酸酸化位点，5个络氨酸酸化位点及6个苏氨酸磷酸化位点；包含73个α-螺旋，46个延长链，21个β-转角和65个无规-则卷曲；可同时定位于细胞质、细胞核和线粒体；与模板5mp9.1.J之间的同源性为37.75%。东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫Encephalitozoon romaleae和肠脑炎微胞子虫Encephalitozoon intestinalis等7个物种的20s PS中均含有5个相同的保守基序（motif1, motif2, motif3, motif4和motif5）。东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫Nosema apis、杀线虫sp Nematocida sp、泛孢虫Pancytospora philotis和毕氏肠微孢子虫Pancytospora philotis的20s PS中均包含Ntn_hydrolase superfamily结构域。东方蜜蜂微孢子虫20s PS（XP_024330780.1）与蜜蜂微孢子虫20s PS（EQB61106.1）聚为一支，进化距离最近。研究结果丰富了东方蜜蜂微孢子虫20s PS的信息，并揭示20s PS可能是亲水性蛋白、胞内蛋白和非跨膜蛋白，东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫的20s PS之间的亲缘关系最近，20s PS在东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫中具有较高的保守性，为深入开展相关功能研究提供依据。     

东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的 生物信息学分析

旨在解析东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）基因STPK的理化性质和分子特性，并对东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫的STPK进行结构域和保守基序预测及系统进化分析，以期丰富东方蜜蜂微孢子虫的STPK信息，并为深入开展STPK的功能研究提供基础。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析STPK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种STPK的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的STPK进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建基于STPK的系统进化树。结果显示：东方蜜蜂微孢子虫STPK基因含2 595个核苷酸，编码的STPK蛋白含864氨基酸。分子量约为101.08 kDa，分子式为C₄₅₂₈H₇₁₅₀N₁₁₆₂O₁₃₇₉S₃₆，脂溶系数为88.48，等电点为5.47；STPK包含40个丝氨酸磷酸化位点，24个酪氨酸磷酸化位点及23个苏氨酸磷酸化位点。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫及柑橘凤蝶（Papilio xuthus）的STPK均含有2个相同的结构域（PK_Tyr_Ser_Thr和Pkinase）与5个相同的保守基序（Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif 4和Motif 5）。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫的STPK序列一致性介于38.14%~61.06%，东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微粒子虫的STPK序列一致性最高（61.06%）。东方蜜蜂微孢子虫STPK（AAJ76_500008712）与颗粒病微粒子虫（Nosema granulosis）STPK（KAF9763807.1）聚为一支，微孢子虫属（KAH9412228.1）、脑炎微孢子虫（KAG5858968.1）和兔脑炎微孢子虫（ECU01_1320）的STPK聚为一支，康氏泰罗汉孢虫（KAF7683612.1）和蝗虫微孢子虫（AAT12343.1）聚为一支。研究结果明确了STPK的理化性质和分子特性，揭示东方蜜蜂微孢子虫和上述其他9种微孢子虫的STPK具有较高的保守性。     

长春地区绵羊和兔隐孢子虫分子流行病学调查

采用抗酸染色法分别对长春地区287份兔粪便样品和167份绵羊粪便样品进行隐孢子虫检查,确认阳性的样品用巢武PCR-RFLP方法扩增隐孢子虫Small-Subunit rRNA基因,选择限制性内切Ssp Ⅰ和Vsp Ⅰ分别对该目的片段单酶切,PCR产物测序后进行RFLP及系统发育分析.结果共检出97份兔粪便和45份羊粪便含有隐孢子虫卵囊,感染率为33.8%和26.9%.巢式PCR-RFLP检测发现由绵羊和兔粪便中分离的隐孢子虫分别是C.parvum和C.bovis,系统发育分析显示隐孢子虫虫种形成了2个群,一个群包括C.parvum,C.boris,C.baileyi,C.meleagridis,C.feti,和C.wrairi,另一个群包括C.andersoni,C.muris和C.serpentis.     

小鹅贝氏隐孢子虫人工感染试验

 笔者用鸭源和鹅源隐孢子虫对13只2日龄小鹅进行了人工感染试验。用鸭源隐孢子虫感染10只小鹅，每只感染1.2×10#+7个孢子化卵囊，潜隐期为3天；用鹅源隐孢子虫感染3只小鹅，每只感染8×10#+6个孢子化卵囊，潜隐期为4天。两组的排卵囊的高峰期均在接种后第7-17天，排卵囊时间长达21天。人工感染后小鹅的严重发病出现在第8-17天。主要临床症状为呼吸困难、气喘、咳嗽、张口呼吸、打喷涕、精神不振、饮、食欲锐减。人工感染后第7、10和17天各死亡一只，死亡率为23%。病理剖检可见喉头、气管水肿，渗出物增多，肺充血、发炎，气囊混浊呈云雾状外观。病理组织学观察可见喉头、气管、法氏囊、泄殖腔粘膜上皮细胞肿胀，微绒毛脱落；粘膜涂片染色和电镜观察可在上述部位的上皮细胞表层发现大量虫体。根据动物感染试验及卵囊的形态特征，确认小鹅隐孢子虫为贝氏隐孢子虫Cryptospridium baileyi。这是世界上首次报道的小鹅隐孢子虫病的病例。     

牛的鼠隐孢子虫（Cryptosporidium muris）在小鼠体内的发育研究

应用光镜及电镜技术对牛的鼠隐孢子虫在小鼠体内的发育进行了研究。结果表明：鼠隐孢子虫的内生发育是在位于鼠胃腺上皮细胞表面、由微绒毛形成的带虫空泡中进行的。其发育过程包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖3个阶段。鼠隐孢子虫所有内生发育阶段的虫体均较小隐孢子虫（C.parvum）大,其中卵囊为1.4倍,子孢子为2.5倍,第一代裂殖体为1.3倍,第二代裂殖体为1.5倍,大小配子体均是1.3倍。对虫体透射电镜观察发现,在虫体和宿主细胞的结合处,虫体前部呈结节状突起,并被宿主细胞的纤维素样增生所包裹,形成一发达的营养器。鼠隐孢子虫的这一结构在小隐孢子虫及相关种中未曾发现。     

鼠隐孢子虫感染犊牛模型的建立及其血液生化指标的变化

【目的】研究犊牛感染鼠隐孢子虫后血液生化指标、营养物质代谢相关酶及激素的变化,初步探讨隐孢子虫病的致病机理。【方法】给犊牛腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液致其免疫力低下,然后通过经口感染鼠隐孢子虫卵囊构建隐孢子虫感染犊牛动物模型。采集模型组和对照组犊牛隐孢子虫感染前和感染后第14、28天的血液,测定血液中K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+、血糖的浓度,以及总蛋白、白蛋白、5-羟色胺、白介素-2的质量浓度和酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶的活性。【结果】经口感染鼠隐孢子虫卵囊犊牛粪便中检出了大小、形态与感染卵囊基本相同的隐孢子虫卵囊,表明隐孢子虫感染犊牛动物模型构建成功。隐孢子虫感染前,2组犊牛所有血液生化指标均无显著差异。与对照组相比,在犊牛感染隐孢子虫后14d,血糖浓度、5-羟色胺质量浓度及碱性磷酸酶、谷草转氨酶活性均差异显著(P0.05);感染隐孢子虫后28d,血糖浓度,白介素-2、5-羟色胺质量浓度及碱性磷酸酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性均发生显著性变化(P0.05)。【结论】成功构建了鼠隐孢子虫感染犊牛动物模型。隐孢子虫感染对犊牛营养物质的吸收利用有一定影响;与营养物质代谢相关的酶与激素对犊牛感染隐孢子虫后营养物质的吸收利用具有一定的调控作用。     

昆虫微孢子虫及其应用的研究进展

昆虫微孢子虫能引起昆虫的疾病,是一种很有应用潜力的微生物杀虫剂,但阻碍其发展的一个重要因素是微孢子虫目前只能用活体培养.微孢子虫有800多种,它们当中大部分能寄生于昆虫,侵染昆虫的中肠、马氏管、脂肪体甚至神经,引起昆虫的流行病.它们不仅在昆虫种群中水平传播,而且还能垂直传播,引起下一代的感染.它是一种重要的昆虫病原原生动物,可以作为防治害虫的一种方法,其应用前景也很广阔.在此报道了微孢子虫及其应用的研究进展.     

鹌鹑隐孢子虫流行病学调查及动物感染试验

为掌握畜禽隐孢子虫病在河南省的流行动态,作者于2003年用饱和蔗糖溶液漂浮法检查了郑州、焦作2市7个鹌鹑养殖场429份粪便样品,结果有5个鹌鹑场隐孢子虫感染为阳性,根据卵囊形态初步鉴定1种为贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi),另1种为火鸡隐孢子虫(Cryptosporidium meleagridis);总阳性率为14．69％(63／429),其中感染贝氏隐孢子虫的阳性率4．66％(20／429),火鸡隐孢子虫的阳性率为10．02％(43／429),并分别用2种卵囊试验感染鹌鹑和雏鸡研究其致病性,观察了2种隐孢子虫在鹌鹑体内的排卵囊规律,以及火鸡隐孢子虫在免疫抑制雏鸡和非免疫抑制雏鸡体内的排卵囊规律。