奶牛活体采卵-体外受精效率的影响因素研究

为建立稳定高效的活体采卵-体外受精技术体系,提高体外胚胎生产效率,本研究先利用屠宰场采集的新鲜卵巢卵母细胞进行体外受精,通过胚胎发育潜力来筛选最佳的体外胚胎培养液;再进一步研究不同种公牛精液和供卵母牛对活体采卵-体外受精效率的影响。结果显示,CR1aa培养液和mCR1aa培养液卵裂率差异不显著（P>0.05）,但mCR1aa组的囊胚发育率显著提高（28.1% vs 20.6%,P<0.05）;选取的3头荷斯坦种公牛精液的活体采卵-体外受精胚胎的卵裂率差异不显著（P>0.05）,但1号种公牛精液体外受精后囊胚率（38.7%）显著高于2号和3号（23.8%&22.9%）（P<0.05）;随机选择的3头活体采卵供体母牛（H1、H2、H3）获得的头均可用卵母细胞数无显著差异,但H1和H2供体母牛体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显著高于H3供体牛（P<0.05）,且H1供体牛体外受精囊胚率显著高于H2供体牛（P<0.05）。结果表明,mCR1aa培养液能显著提高体外受精囊胚发育率,适用于体外胚胎生产;种公牛精液和供体母牛个体差异会直接影响活体采卵-体外受精胚胎的生产效率,为奶牛活体采卵-体外受精生产技术体系的优化提供参考。     

牛体外受精卵的二步法培养体系的研究

以CR1aa为基础培养液,采用二步法对牛体外受精卵进行体外培养,完善牛体外受精卵的培养体系.实验一:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa 3 mg/mLBSA培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的囊胚率显著高于对照组,但卵裂率和囊胚孵化率无显著差异.实验二:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的卵裂率显著高于对照组,但囊胚率和囊胚孵化率差异不显著.实验三:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1mmol/L GSH培养,处理组前3 d为CR1aa 0.1 mmol/L GSH培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1 mmol/L GSH.处理组的卵裂率显著高于对照组,囊胚率极显著高于对照组,但囊胚孵化率差异不显著.结果表明,GSH与二步法培养系统结合相对于传统的一步法培养系统更适于牛体外受精卵的体外培养.     

不同培养体系对牛胚胎体外发育的影响

采用离子霉素和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)对牛体外成熟卵母细胞进行联合激活,激活后采用不同的培养体系进行体外培养,观察不同的培养液对牛孤雌激活胚体外发育能力的影响。3种培养体系分别为:A(0~48 h:CR1aa+3 mg/mL BSA;48 h~7 d:CR1aa+10%FBS),B(连续7 d均为SOFaa+3 mg/mL BSA),C(0~5 d:SOFaa+3 mg/mL BSA;6~7 d:SOFaa+10%FBS)。结果表明:3种培养液对卵裂率没有显著性影响,分别为87.22%,94.33%和91.30%,但囊胚发育率存在显著性差异,以A效果最好,其囊胚发育率为25.56%;C次之,囊胚发育率为11.80%;B最低,囊胚发育率为3.55%。之后选择最佳的培养液进行体外受精实验,结果表明CR1aa可用做牛胚胎体外生产的培养液。     

四种培养液对牦牛孤雌胚胎发育的影响

为探讨不同培养液对牦牛早期胚胎发育的影响,本试验将经过孤雌激活后的牦牛卵母细胞分别置于m SOF,G1/G2,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养四种体外培养液中进行体外培养。结果表明,四种培养液对胚胎的卵裂率影响差异不显著,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚率显著高于m SOF和G1/G2组,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚率之间没有显著差异,但是CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚孵化率显著高于CR1aa组,说明CR1aa颗粒细胞共培养可作为较为合适的牦牛早期胚胎培养液。     

牛体外胚胎高效生产技术优化研究

为了探讨小卵泡液、放线菌酮(CHX)对卵母细胞预成熟、囊胚滋养层细胞囊泡(TVS来源于体外受精培养14 d的滋养层细胞)、维生素对牛体外胚胎质量的影响。在B超仪下进行牛活体取卵(OPU),从牛活体卵巢采集卵母细胞,进行体外成熟、体外受精、早期胚胎体外培养。结果表明:10%小卵泡液及8%CHX的卵母细胞预成熟4 h组显著优于对照组;在体外受精及早期胚胎培养液CR1aa中添加10μg/m L维生素C组与TVS共培养组的卵裂率和囊胚发育率均高于其他试验组(P0.05);体外胚胎与TVS共移植受胎率显著高于对照组(P0.05)。说明活体采集的卵母细胞经体外预成熟处理,可以达到核质同期化的目的,早期胚胎的培育过程中加入TVS、抗氧化剂等可以克服早期胚胎的发育阻滞,提高体外胚胎的囊胚发育率。     

黄淮白山羊孤雌胚胎的体外培养

采用离子霉素和6-DMAP对黄淮白山羊体外成熟卵母细胞进行联合激活,分别在不同的培养体系进行体外培养,观察孤雌胚胎的发育情况。培养体系分别为:无共培养条件下,M199(10?S)、CR1aa和HTF P1;颗粒细胞共培养条件下,CR1aa、HTF P1和SOFaa。结果发现,无共培养条件下,CR1aa和HTF P1组孤雌胚胎的卵裂率显著高于M199组(P<0.05),但3组均未有囊胚;共培养条件下,HTF P1组的卵裂率显著高于CR1aa和SOFaa组(P<0.05),而CR1aa组的囊胚率却显著高于其他2组(P<0.05)。综合试验结果说明,CR1aa联合颗粒细胞共培养能够获得较好的培养效果,适用于山羊孤雌胚胎的体外培养。     

绵羊卵母细胞采集、体外成熟和胚胎体外培养对体外受精技术效率的影响

利用屠宰场采集的绵羊卵巢作为试验材料,研究了不同卵母细胞采集方法(卵泡冲洗法、剖切法、注射器抽吸法和真空泵抽吸法)、成熟液中添加不同来源激素(BIONICHE或宁波激素厂生产 FSH/LH)和血清(发情绵羊血清或胎牛血清),以及mSOF和mCR胚胎培养体系对绵羊体外受精各环节效率的影响。结果表明,卵泡冲洗法获得A、B两级卵母细胞比例为77.1%,显著高于其他3种方法(P＜0.05),添加BIONICHE FSH/LH+ESS成熟液中,卵母细胞成熟率显著高于其他添加方式(P＜0.05),mSOF和mCR胚胎培养体系在卵裂率上无显著差异(P＞0.05),但mSOF组中囊胚率和孵化率均显著高于mCR组(P＜0.05)。综上所述,本研究中卵泡冲洗法更适合绵羊卵母细胞采集,成熟液中添加BIONICHE FSH/LH和ESS可显著促进绵羊卵母细胞成熟;与mCR培养体系相比,mSOF培养体系更适合绵羊体外受精胚胎的发育。     

C型钠肽和半胱胺前成熟处理对牛卵母细胞发育能力的影响

本研究旨在探讨C型钠肽(CNP)结合半胱胺前成熟处理牛卵母细胞对其减数分裂和发育能力的影响。以常规的体外成熟24 h培养为对照,CNP前成熟(添加或不添加半胱胺)处理牛卵母细胞6 h,然后进行常规体外成熟培养,检测卵母细胞的成熟率以及体外受精后胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数。结果表明:与对照组相比,不论有无添加半胱胺,CNP前处理牛卵母细胞均未显著提高牛卵母细胞的成熟率和体外受精后的卵裂率(P0.05),但显著提高了受精后囊胚细胞总数(P0.05);CNP结合半胱胺前处理牛卵母细胞显著提高了受精后的囊胚率(P0.05)。由此可见,CNP结合半胱胺前成熟处理牛卵母细胞提高了其发育潜能,可用于优化卵母细胞体外成熟培养体系。     

牛体外受精胚胎卵裂阶段对其体外发育能力影响的研究

将经过体外成熟培养（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）后获得的牛早期胚胎，按其所处卵裂阶段的不同，划分为２细胞、３～４细胞和５细胞以上３个试验组，在体外条件下继续培养到发育囊胚和孵化囊胚阶段，以观察在胚胎早期，受精卵裂发育的快慢与其后胚胎所获得的继续发育能力的关系。结果显示，牛早期胚胎体外囊胚发育率的高低，与其在体外培养（ＩＶＣ）前卵裂发育的快慢成正比。在ＩＶＦ后４２～４６ｈ处于２细胞、３～４细胞和５细胞以上卵裂阶段的早期胚胎，其囊胚发育率分别为６．５％、２１．４％和４４．９％，差异非常显著（Ｐ＜０．００１）；而经过７～９ｄ的ＩＶＣ后仍滞留在ＩＶＣ前原卵裂阶段，丧失继续发育下去能力的胚胎比率则分别为５１．６％、３２．７％和２５．７％，与其ＩＶＣ前卵裂发育的快慢成反比。在ＩＶＦ后６６～７０ｈ仍处于２细胞和３～４细胞卵裂阶段的早期胚胎，其体外发育能力明显降低，囊胚发育率只有１．３％和８．２％；而滞留胚胎率则分别高达９０．９％和５９．４％。结果表明，牛体外受精早期胚胎卵裂发育的快慢，直接影响到其后体外发育的能力。     

体外受精不同时间等因素对体外受精效果的影响

本试验对牛体外受精不同时间、不同的培养液成分和培养方法等对奶牛体外受精后的卵裂率、囊胚发育率的影响进行了研究。试验包括:(1)牛体外受精不同时间(8h、20h)对奶牛体外受精后的卵裂率、囊胚发育率的影响;(2)不同的培养液成分对奶牛体外受精早期胚胎发育的影响。研究结果表明:(1)牛体外受精时间20h对奶牛体外受精后的卵裂率(78%)好于体外受精8h组(76%),但囊胚发育率前者不如后者好(20.51%VS23.68%),两者间差异不显著(P0.05)。(2)作为早期胚胎的培养液IVD101、TCM199培养系的卵裂率分别为76%、74%,而囊胚率却分别为22.37%、22.97%,TCM199培养系好于IVD-101,但两者间差异不显著(P0.05)。     

不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。     

荷斯坦奶牛与和牛活体采卵-体外受精（OPU/IVF）体系的建立及应用

[目的]研究牛活体采卵-体外受精（ovum pick-up and in vitro fertilization,OPU/IVF）体系,建立高效的牛体外胚胎生产系统。[方法]以从屠宰场采集的健康牛新鲜卵巢为试验材料,进行卵母细胞体外成熟、体外受精、体外胚胎培养相关条件的摸索,重点考查体外胚胎培养液中添加瘦素（leptin）对囊胚率的影响。选取13～15月龄健康荷斯坦奶牛及和牛各10头作为供体,进行活体采卵、卵母细胞体外成熟、体外胚胎生产,记录可用卵数及可用囊胚数,统计卵裂率、囊胚率;2个品种牛的体外冷冻胚胎解冻后,以荷斯坦奶牛为受体进行胚胎移植,移植后45 d统计妊娠率。[结果]添加30 U/mL的leptin可以显著（P<0.05）提高屠宰场来源牛体外胚胎的囊胚率。随机选择供体牛活体采卵,平均每头荷斯坦奶牛获得可用卵7.5枚,平均每头和牛获得可用卵8.1枚;荷斯坦奶牛及和牛的卵裂率分别为84.00%、82.71%,二者差异不显著（P>0.05）。体外培养条件下,平均每头荷斯坦奶牛获得可用囊胚4.3枚,平均每头和牛获得可用囊胚3.7枚;荷斯坦奶牛的囊胚率（57.33%）显著...     

不同脱除卵丘细胞方式对牛体外胚胎生产效果的影响

为了提高牛体外受精性控胚胎发育率,试验从体外受精（IVF）培养8 ｈ后的胚胎,采用不同的脱除卵丘细胞方式（机械脱除法、酶脱除法、振荡法）脱除卵丘细胞,研究影响牛性控精液体外受精效率的关键技术。结果表明,在体外受精8 h后,采用不同的脱除卵丘细胞方式（机械脱除法、酶脱除法、振荡法）脱除卵丘细胞,受精卵经体外培养48 h后统计胚胎卵裂率分别为（58.8±2.8）%、（58.5±5.7）%、（69.9±3.4）%,体外培养192 h统计囊胚率分别为（26.7±2.7）%、（26.9±3.9）%、（35.8±4.1）%,由此可见,振荡法显著优于机械脱除法和酶脱除法（P〈0.05）。性控精液体外受精时,体外受精8 h后采用振荡法脱除卵丘细胞对于提高性控精液体外受精胚胎发育率具有重要意义。     

牛体外受精胚胎卵裂阶段对其体发育能力影响的研究

将经过体外成熟培养（ＩＶＭ），体外受精（ＩＶＦ）后获得的牛早期胚胎，按其所处卵裂阶段的不同，划分为２细胞、３～４细胞和５细胞以上３个试验组，在体外条件十继续培养到发育囊胚和孵化囊胚阶段，以观察在胚胎早期，受精卵裂发育的快慢与其后胚胎所获得的继续发育能力的关系。结果显示，牛早期胚胎体囊胚发育率的高低，与其在体外培养（ＩＶＣ）前卵裂发育的快慢成正比。在ＩＶＦ后４２～４６ｈ处于２细胞、３～４细胞和５细胞     

以囊胚双重染色方法检测果糖对胚胎早期发育效果的影响

本试验结合囊胚细胞(TCM/TE)双重染色方法研究了果糖代替葡萄糖后对牛早期胚胎体外发育效果的影响。结果显示,对第8d囊胚双重染色时,以TritonX-100处理60-69s为宜,TCM细胞数和囊胚细胞总数分别为48.2±12.4和142.5±30.1,二者之比约为0.33;果糖组与葡萄糖组卵裂率(62.2%±3.87vs61.7%±2.89)、囊胚率(32.1%±1.73vs29.7%±4.16)差异均不显著(P0.05),而且,TCM细胞数(43.6±14.5vs40.2±11.3)和TE细胞数(99.3±26.7vs89.9±24.8)差异也不显著(P0.05)。但是数据显示,囊胚细胞总数果糖组要高于葡萄糖组(142.3±21vs136.2±35,P0.05),说明果糖可以代替葡萄糖作为早期胚胎体外培养的能量代谢底物,而且可以提高囊胚质量。     

封闭式拉长细管冷冻牛卵母细胞的研究

为探索封闭式拉长细管(closed pulled straw,CPS)冷冻牛卵母细胞的效果,将牛卵母细胞分别采用细管、开放式拉长细管(open pulledstraw,OPS)和CPS 3种方法进行冷冻,解冻后进行体外成熟、体外受精和胚胎体外培养。采用CPS法分别对GV期和成熟(MII期)牛卵母细胞进行冷冻保存,解冻后将卵母细胞培养至成熟,进行体外受精和胚胎体外培养。结果显示:OPS组和CPS组卵母细胞的正常形态率分别为83.1%和77.8%,成熟率分别为66.9%和64.4%,卵裂率分别为45.8%和43.4%,囊胚率分别为6.6%和6.0%,组间上述指标差异均不显著(P>0.05);但OPS和CPS组上述4项指标均显著高于细管冷冻组(P<0.05)。解冻后GV期和MII期卵母细胞卵裂率分别为44.5%和57.3%,囊胚率分别为6.8%和17.9%,组间卵裂率和囊胚率差异均显著(P<0.05)。结果表明:CPS法既具有OPS法快速降温的优点,同时,还能避免卵母细胞和液氮直接接触,降低卵母细胞通过液氮被污染的风险。因此,CPS冷冻法可以用于牛卵母细胞的冷冻。     

高通量SNP芯片在牛体外早期胚胎染色体质量鉴定中的初步应用

旨在基于高通量SNP芯片建立一种可评估牛早期胚胎染色体质量和生产性能的方法,为胚胎牛育种提供技术支撑。本研究通过胚胎切割技术分别对荷斯坦奶牛体内囊胚(n=27)、体外囊胚(n=21)、体外2细胞胚胎(n=6)和8细胞胚胎(n=5)进行切割取样并统计发育率,其中体内囊胚组分为1/2体内胚组(切取半个胚胎)和体内滋养层(trophoblast cells, TE)组(切取体内胚胎少量TE),体外囊胚组、体外2和8细胞胚胎分别为体外TE组(切取体外胚胎少量TE)、体外2细胞(切取体外2细胞胚胎的1个卵裂球)和8细胞组(切取体外8细胞胚胎的1个卵裂球)。切割取样后进行全基因组扩增(whole-genome amplification, WGA),对扩增成功且DNA量大于1 000 ng的样品进行SNP芯片检测,芯片检出率大于90%的进行生产性能评估,低于90%的进行染色体片段缺失分析和数据填充。结果显示：1)切割部分TE后,体内TE组剩余部分和体外TE组剩余部分继续培养24 h后的发育率分别为(94.4±5.6)%和(90.5±6.6)%,而1/2体内胚组剩余部分的发育率显著降低,仅为(22....     

牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究

探讨了人工合成培养液ＣＲ１ａａ和小鼠胎仔成纤维细胞对牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明，牛体外受精卵在ＣＲ１ａａ液中的卵裂率达７６．２％，８细胞胚的比率达４４．８％。小鼠胎仔成纤维细胞能够显著促进牛体外受精的早期囊胚以上胚胎的发育。牛体外受精后第５、６天的早期胚胎分别与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，在受精后第７天发育至囊胚以上的比率分别达１９．８％和２４．６％；受精后第８天，孵化的囊胚比例分别达５．２％和７．５％。实验表明，受精后第５、６天的牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，可显著提高扩张囊胚和孵化囊胚数量。小鼠成纤维细胞对胚胎发育的支持作用取决于胚胎发育阶段     

体外受精生产性控犏牛胚胎条件的优化

为提高性控犏牛胚胎体外发育率,从性控精液的精子密度、受精时间、卵丘细胞的脱除程度、胚胎培养体系和胚胎培养环境各个环节进行优化。结果表明:(1)受精24h的卵裂率和囊胚率显著高于受精6h、18h(P0.05);(2)性控精液的精子密度0.4×10~6~0.6×10~6个/mL时的卵裂率显著低于4×10~6~6×10~6个/mL组(P0.05),但囊胚率差异不显著(P0.05),均显著高于性控精液0.04×10~6~0.06×10~6个/mL的卵裂率和囊胚率(P0.05);(3)卵丘细胞不脱除组的囊胚率(23.42%)显著高于半脱除组(13.77%)和完全脱除组的囊胚率(15.61%)(P0.05);(4)输卵管上皮细胞共培养的囊胚率(24.63%)和卵丘细胞共培养的囊胚率(23.42%)差异不显著(P0.05),但均显著高于FBS CR1aa培养液的囊胚率(P0.05);(5)性控犏牛早期胚胎在低氧培养环境下囊胚率(23.42%)显著高于高氧培养环境(11.83%)(P0.05),而孵化囊胚率差异不显著(P0.05)。结果说明,生产性控犏牛胚胎最佳的条件是性控精液的浓度0.4×10~6~0.6×10~6个/mL,受精时间为24h,采取卵丘细胞不脱除的方法,胚胎培养方式采用输卵管上皮细胞共培养的方式,胚胎培养环境采用低氧环境。     

玻璃化冷冻牛体外受精胚胎不同解冻方法试验研究

用添加5％犊牛血清(FCS)的TCM-199进行卵母细胞成熟,BO液进行体外受精后,在5％犊牛血清的CR1aa液进行体外培养获得牛体外受精胚胎。经玻璃化冷冻保存,解冻后分别用分步脱出保护剂和一步脱出冷冻保护剂后,进行孵化试验,解冻后透明带完整率为100％,解冻后分步脱出保护剂和一步脱出保护剂存活率分别为90％(36／40)、50％(20／40);囊胚孵化率分别为80.6％(29／36)、35％(7／20);48小时存活率分别为52.8％(19／36)、20％(4／20);两者间差异极显著(P<0.01)。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养孵化,分步法脱出保护剂,培养囊胚孵化率分别为83.3％(15／18)、77.8％(14／18);48小时存活率分别为55.6％(10／18)、50.0％(9／18)。两者差异不显著(P>0.05)。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养,一步法脱出保护剂囊胚孵化率分别为40％、30％,两者差异不显著(P>0.05)。48小时存活率相同,为20％。本试验结果表明,玻璃化冷冻胚胎,分步法添加保护剂,解冻后分步脱出保护剂可以获得较高的存活率和囊胚孵化率。