基于N蛋白小反刍兽疫病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立一种小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的快速检测方法,本研究将pET-32a-N重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达、纯化获得重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,制备了抗PPRV-N蛋白的单克隆抗体并进行HRP标记,通过优化反应条件建立了PPRV阻断ELISA抗体检测方法。经评价该方法与PIV、GTPV、ORFV的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶160稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(C_v)均小于10%;通过对180份临床血清样品进行检测,该方法与竞争ELISA试剂盒的符合率为96%。表明建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性与可重复性,可用于PPRV抗体的检测,为PPRV疫苗的免疫效果评估及疫病防控提供了技术支持。     

小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备及间接ELISA检测方法的建立

将编码小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的基因全长克隆到pBacPAK9载体中,并在昆虫细胞中进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析,并用PPRV阳性血清进行了Western blot鉴定。用Ni-IDA亲和柱对组氨酸融合表达的N蛋白进行了纯化,并对纯化产物进行了理化性质和抗原活性分析。最后以表达的N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,临床检测137份山羊血清并与IDvet公司的商品化PPRV抗体检测试剂盒进行比较。结果表明,制备的PPRV N蛋白抗原在溶液中以单体形式存在,具有非常好的抗原活性。用该蛋白建立的间接ELISA检测方法与IDvet试剂盒符合率为956%。本研究为小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备相关质量标准的建立奠定了基础,同时建立的ELISA抗体检测方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

小反刍兽疫病毒竞争ELISA检测试剂盒生产工艺研究

为研究小反刍兽疫病毒（PPRV）竞争ELISA试剂盒的生产工艺,本试验利用昆虫细胞表达的PPRV核蛋白及其单克隆抗体,建立一种特异性高、敏感性强的PPRV竞争ELISA检测方法,并对该方法的各个步骤进行优化,确定该方法的最适条件,从而确定竞争ELISA的操作程序。并用该方法与OIE推荐的PPRV rC-ELISA抗体检测试剂盒同时检测来自西藏、内蒙古共977份临床羊、牛血清样本,结果显示特异性、敏感性、符合率分别达99.89%、93.82%、99.38%。本研究建立的PPRV竞争ELISA方法为该病毒检测试剂盒的研制奠定技术基础,为小反刍兽疫的防控提供科学依据。     

小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

用基因工程表达的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗PPRVH蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C6和4B10),其细胞培养上清液ELISA效价分别为1:256和1:128,腹水ELISA效价分别为1:128000和1:64000。亚型鉴定表明,2C6和4B10分别为IgG2b和IgG2a。ELISA结果显示,2株单克隆抗体仅与PPRVH蛋白和PPRV反应,不与其它相关病毒反应,表明2株单克隆抗体特异性良好。这2株单克隆抗体的获得为研究PPRVH蛋白生物学特性及建立PPRV免疫学检测方法奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

本研究利用原核表达的小反刍兽疫病毒核衣壳（N）蛋白作为标准抗原蛋白,建立PPRV抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 mg/L,血清最佳稀释度为1∶40,二抗的使用浓度为1∶200,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应时间为37 ℃ 15 min。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。经过临床样品检测证明,建立的检测方法可用于临床PPRV抗体的检测。     

小反刍兽疫病毒N基因重组杆状病毒的构建及间接ELISA抗体检测方法的建立

本研究旨在建立基于真核表达的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的诊断小反刍兽疫的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有PPRV N基因的重组供体质粒pFastBacHTA-N,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒pBacmid-PPRV-V,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid-PPRV-N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。临床检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心(CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较,特异性为96.2%,敏感性为100%,二者的符合率达到96.9%。结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达与间接ELISA检测方法的建立

小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白,也是诊断小反刍兽疫的主要靶蛋白。为获得高效表达的可溶性N蛋白,并建立基于N蛋白的小反刍兽疫的间接ELISA检测方法,通过优化密码子、优化表达条件等条件探索,在大肠埃希菌表达系统中获得了高效表达的可溶性N蛋白,进一步基于N蛋白建立了间接ELISA检测方法,该方法对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数均低于9%,具有良好的重复性。对480份临床血清样品进行检测,同时用法国IDVET竞争ELISA试剂盒进行比较,符合率达到98.33%。本研究为进一步开发成熟的小反刍兽疫抗体检测试剂盒奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒新疆株的N基因序列分析

为了分析小反刍兽疫病毒(PPRV)新疆株的分子演变特点,从Gen Bank数据库中下载所有国家全部PPRV的N基因全序列,应用DNAStar软件进行序列分析。结果显示:PPRV中国新疆株,与中国内地流行毒株核苷酸同源性最高,为99.2%~99.9%;与之前中国西藏毒株核苷酸同源性为98.1%;与中国所用疫苗株核苷酸同源性为93.6%。与其他国家毒株相比,核苷酸同源性最低的是韩国毒株,同源性最高的是印度毒株。N基因系统进化关系分析显示,PPRV中国新疆株属于基因Ⅳ系。N蛋白氨基酸同源性结果与核苷酸比对结果相似。PPRV中国新疆株存在一定程度变异,可能为周边国家传入。     

小反刍兽疫病毒N基因的原核表达

目的是表达出小反刍兽疫病毒的核蛋白,并鉴定其活性.根据GenBank发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列,对其进行基因优化并合成.设计引物,利用PCR的方法扩增PPRV-N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达栽体pET-28a-N.阳性质粒转化原核...     

快速检测小反刍兽疫病毒RT—LAMP方法的建立

本研究采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测小反刍兽疫病毒(PPRV)的方法.针对PPRV-N基因保守区域设计4条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,可以实现DNA的梯状等温扩增.优化RT-LAMP的反应体系,并检验其灵敏性、特异性.一步法RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测结果出现仅需70 min,该方法具有良好的特异性,与同属的犬瘟热病毒无交叉反应,灵敏度是RT-PCR的1 000倍,是巢式RT-PCR的100倍.结果证明,RT-LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测PPRV,在基层和实验室都具有良好的应用前景.     

小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的表达与ELISA检测方法的建立

通过对下载的16株小反刍兽疫病毒（PPRV）N基因片段进行序列分析,合成了PPRV N基因。用NP1和NP2引物扩增。纯化的PPRV N基因在T4DNA连接酶的作用下,和PET32-a载体进行连接反应构建重组质粒pET-a-PPRV-N。经诱导表达和纯化后,得到了大量的PPRV N蛋白。用PPRV N蛋白制备免疫血清,经国际标准血清标化后作为参考阳性血清,同时以PPRV N蛋白为抗原建立间接ELISA（I-ELISA）方法。对山东省的467份羊血清检测,使用S/P（样品值/阳性值）平均值加3倍标准差的方法,计算出其临界点为0.28。应用间接ELISA和针对H蛋白的单抗为基础的C-ELISA检测来自于疫区的69份血清,结果两者的符合率为79.7%。     

小反刍兽疫病毒研究进展

小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus,PPRV)引起的小反刍兽疫(Pastedespetitsruminants,PPR)是一种主要发生于山羊、绵羊及一些野生小反刍兽的类似牛瘟症状的烈性接触性A类传染病。本病自1940年在象牙海岸首次记述以来,先后在非洲、中东一些国家发生。目前,在撒哈拉和赤道之间的大多数非洲国家,包括阿拉伯半岛、以色列、叙利亚、伊拉克、约旦和土耳其在内的中东地区、以及南亚的印度半岛均有此病流行,我国至今尚无此病的报道。本文就PPRV的形态特征、基因组成、蛋白组成、流行病学、复制、培养及检测等方面的研究进展作一综述。     

Establishment and application of a solid-phase blocking ELISA method for detection of antibodies against classical swine fever virus

BackgroundClassical swine fever (CSF) is a severe infectious disease of pigs that causes significant economic losses to the swine industry.ObjectivesThis study developed a solid-phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay (spbELISA) method for the specific detection of antibodies against the CSF virus (CSFV) in porcine serum samples.MethodsA spbELISA method was developed based on the recombinant E2 expressed in Escherichia coli. The specificity of this established spbELISA method was evaluated using reference serum samples positive for antibodies against other common infectious diseases. The stability and sensitivity were evaluated using an accelerated thermostability test.ResultsThe spbELISA successfully detected the antibody levels in swine vaccinated with the C-strain of CSFV. In addition, the detection ability of spbELISA for CSFV antibodies was compared with that of other commercial ELISA kits and validated using an indirect immunofluorescence assay. The results suggested that the spbELISA provides an alternative, stable, and rapid serological detection method suitable for the large-scale screening of CSFV serum antibodies.ConclusionsThe spbELISA has practical applications in assessing the vaccination status of large pig herds.     

牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究以经蔗糖密度梯度离心法纯化的IBRV作为免疫原制备1株单克隆抗体(MAb),命名为cp-1-1。经间接ELISA、IFA和western blot鉴定,该MAb与IBRV呈阳性反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及牛副流感病毒3型(BPIV3)呈阴性反应,具有较强的特异性。质谱分析结果显示MAb cp-1-1识别的表位位于IBRV VP8蛋白。以纯化的IBRV作为包被抗原、MAb cp-1-1作为检测抗体,建立检测IBRV血清抗体的阻断ELISA方法。该检测方法的抗原包被量为0.89μg/孔,样品稀释度为12,检测抗体MAb量为1.3μg/孔,二抗稀释度为15000。利用50份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清(中和抗体效价为14~116)作为标准参考血清,确定该检测方法的阻断率Cut Off值为52.06%,即阻断率高于52.06%时判为阳性,低于52.06%时判为阴性。阻断ELISA方法特异性试验显示仅IBRV阳性血清检测为阳性,而BVDV、BPIV3、牛腺病毒3型(BADV-3)和O型口蹄疫病毒(O-FMDV)阳性牛血清均检测为阴性,表明该方法具有较强的特异性;该方法可检测的最低中和抗体效价为14,与病毒中和试验的敏感性一致,表明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示该方法批内、批间变异系数均小于10%,显示较好的重复性。对130份现地牛血清检测结果显示,该方法与病毒中和试验的符合率为98.46%。用该方法对某牛场接种IBRV灭活疫苗的牛血清进行检测,抗体阳性率为99.51%(205/206)。另外,采用该方法对我国8个省(市、自治区)的801份牛血清进行检测,IBRV的抗体阳性率为41.6%(333/801)。本研究建立的阻断ELISA方法可以用于IBRV疫苗免疫监测和血清流行病学调查,为我国IBR的防控提供技术支持。     

经密码子优化的小反刍兽疫病毒H蛋白在昆虫细胞中的表达

小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）属于副黏病毒科、麻疹病毒属成员。本实验室已经证明,该病毒的囊膜糖蛋白H蛋白在未经密码子优化条件下难以在昆虫细胞中表达。本研究首先对其密码子进行优化,然后构建了在昆虫细胞中表达该蛋白的重组杆状病毒。经Western-blot和间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒在昆虫细胞中能够表达H蛋白,但表达量相对较低。     

小反刍兽疫病毒H蛋白的表达及间接ELISA方法的建立

利用原核表达系统表达了小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)血凝素蛋白(H)作为ELISA包被抗原,建立了PPR抗体检测的间接ELISA方法,并对所建立方法的相关条件进行了优化。优化结果显示:抗原的最佳包被质量浓度为20mg/L;血清最佳稀释度为1∶80;酶标二抗的最佳浓度为1∶20 000;抗原抗体反应时间和酶标二抗孵育时间均为45min。批内及批间重复试验结果变异系数均小于10%,说明该方法具有较好的可重复性。检测羊口疮、羊痘、蓝舌病和山羊支原体血清结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。检测临床血清样品80份,并与国外c-ELISA试剂盒比较,符合率为93.75%。因此,本方法可以用于小反刍兽疫的临床血清抗体检测及流行病学调查。     

氯霉素残留检测阻断ELISA试剂盒的研制及性能测定

在建立氯霉素单克隆抗体（CAP mAb）杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上．研制出CAP残留快速检测试剂盒（CAP-kit），并对其性能进行了测定。结果表明，CAP-kit的标准曲线呈典型的S型，符合4参数logit曲线拟合，相关系数R^2=0．9953，检测范围为1．0μg/L～128．0μg/L，灵敏度为0．85μg／L，半数抑制浓度（IC50）为7．54μg/L，检测限为1．0μg/L；牛奶样、猪肉样的平均添加回收率为88．3％、82．5％，平均批内和批间变异系数均〈15％；CAP-kit与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应（CR％）为150％，与其它酰胺醇类和抗菌素药物无交叉反应；试剂盒在4℃可保存6个月。     

小反刍兽疫病毒N基因部分序列分子演化规律

为分析中国小反刍兽疫的流行特点,本研究采用生物信息学方法,从NCBI下载小反刍兽疫病毒(PPRV)N基因,以最大似然法建立分子进化树。结果显示,中国PPRV流行株分布于Ⅳ系,有2个分支,2007-2008年中国西藏流行株与2003年印度毒株遗传关系最近,2013-2015年中国西藏流行株与2012年巴基斯坦毒株遗传关系最近。中国小反刍兽疫主要发生于山羊,2015年新疆巴州毒株来自阿尔卑斯野山羊,与2013年以来的毒株在同一分支。China-BJ_2014与China-XJBZ_2015的遗传距离为0.011 7。中国两簇PPRV分支均与西部邻国毒株遗传关系最近,目前出现多宿主和变异性的流行特点,本研究为有效防控PPRV疫情提供基本的科学依据。