一株牦牛源G6P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定及部分基因的序列分析

本研究的目的是分离、鉴定牦牛源牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)。将经RT-PCR检测BRV阳性的牦牛腹泻粪便样本接种MA-104细胞,进行病毒分离和鉴定,并对其VP4、VP6和VP7完整基因进行测序,分析其分子特征。结果显示:病毒盲传3代后出现细胞病变,至第7代后出现细胞病变的时间稳定,经蚀斑纯化后测得病毒滴度为10^8.39TCID₅₀·mL^-1。分离株经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察证实为BRV,命名为HY-1株;扩增HY-1株VP4、VP6和VP7完整基因序列,分析表明HY-1株为G6P[11]I2型;系统发育树显示,HY-1株VP4、VP6和VP7节段分别与中国牛源DQ-75株和印度牛源M-1和RUBV319株遗传演化关系最近,可能为重配毒株。与国内的G6型和P[11]型BRV毒株相比,HY-1株的VP4和VP7蛋白重要氨基酸位点变化较大。成功分离得到一株牦牛源BRV,基因型为G6P[11]型,为我国首次报道。     

牦牛源牛链球菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

本研究旨在从腹泻牦牛粪便中分离鉴定牛链球菌,并分析其溶血性、对小鼠的致病性及对抗菌药物的敏感性。将川西北阿坝州45份腹泻牦牛粪便于血平板上划线,37℃、5% CO₂培养24 h分离细菌,经16S rRNA序列扩增测序和系统发育分析鉴定出14株牛链球菌,其中8株巴黎链球菌,6株解没食子酸链球菌巴氏亚种;9株呈α溶血,5株呈β溶血。分离鉴定的牦牛源巴黎链球菌和解没食子酸链球菌巴氏亚种能引起试验小鼠的轻度腹泻;药敏试验结果显示分离菌株对青霉素、头孢噻肟、万古霉素、乙酰螺旋霉素、环丙沙星、利福平、替考拉宁、氨苄西林和庆大霉素共9种抗生素高度敏感,对链霉素、卡那霉素、林可霉素、红霉素、四环素和克林霉素耐药率较高。本研究阐明了牦牛源链球菌的部分生物学特性,为该病的防控奠定了基础。     

我国牦牛源冠状病毒流行现状分析

为了解我国牦源牛冠状病毒(BCoV)流行现状,通过查阅文献资料方法,汇总分析我国牦牛主产地区的BCoV检测情况。资料显示:2012年以来,我国青海、四川、新疆、西藏等牦牛主产省(自治区)的牦牛群中普遍存在BCoV感染且感染率较高,平均血清抗体阳性率多在80%以上,病原学阳性率多在60%以上。需采取加强饲养管理、控制混合感染、做好隔离净化等措施,控制牦牛群中的BCoV流行。我国的BCoV研究起步较晚,流行病学方面的报道较少,有必要进一步加强该病毒在牦牛中致病机理、流行情况和防治技术等方面的调查研究。本文为掌握我国牦牛中的BCoV流行情况及其防控提供了参考。     

表达牛冠状病毒S1基因的重组人腺病毒的构建及鉴定

为构建表达牛冠状病毒(BCV)S1基因的重组人腺病毒疫苗,本实验通过人工合成密码子优化的截短BCV S1的基因片段(55 bp～1 650 bp)。将其克隆到重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,并以PmeⅠ线性化后转化含有人5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞,通过细菌内同源重组的方式获得重组腺病毒质粒pAdV-BCV-S1,经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞获得重组腺病毒rAdV-BCV-S1。利用间接免疫荧光法和western blot法检测该重组腺病毒的S1基因在AD-293细胞中的表达情况,同时用一步生长曲线法,测定该重组腺病毒的复制能力。结果表明:BCV S1基因在感染细胞中获得了高效表达:子代重组腺病毒在感染细胞后60 h滴度最高,为6.8×108 pfu/mL。该重组腺病毒的构建为BCV重组疫苗的研究奠定了基础。     

牦牛源牛凸隆病毒的检测及其基因组特征

本研究旨在证实青藏高原牦牛中牛凸隆病毒（bovine torovirus,BToV）的存在,并分析其基因组特征。采用RT-PCR方法检测西藏、青海、四川藏区的犊牦牛腹泻粪便中BToV,并扩增基因组。结果从145份样本中检出10份BToV阳性,平均阳性率约为6.9%,其中西藏、青海、四川藏区的阳性率分别约为11.8%、8.9%、3.0%。成功获得1个长为28 314 bp的牦牛源BToV基因组,GC含量为36.31%,与GenBank中已有的5个BToV基因组的核苷酸相似性为82%～97%,与国内BToV基因组SC2的相似性最高且遗传关系最近。本研究中BToV基因组的S基因与GenBank中已有的14个完整BToV-S基因相比,存在8个独特的氨基酸变异,其中,6个位于S1结构域,2个位于S2结构域,且在222—2 473 bp发生区域重组事件。本研究证明BToV在牦牛中的存在,并且地域分布广泛,获得了牦牛源Ⅲ型BToV基因组,报道了BToV的S基因重组事件,有助于进一步了解BToV的分子特征和遗传进化。     

牛冠状病毒S基因的序列分析及原核表达

为了解牛冠状病毒（bovine coronavirus,BCoV）的S基因变异情况并建立ELISA检测方法,本研究对采自不同牛场的新生犊牛腹泻（CD）和成年牛冬痢（WD）腹泻样本提取总RNA,反转录合成cDNA,利用PCR扩增S全基因和S1基因。将S1基因目的片段连接表达载体pET-32a （+）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达。结果显示,CD与WD分离株S基因核苷酸为98.4%,CD和WD分离株与参考毒株BCoV-ENT株核苷酸同源性最高,分别为98.4%和98.5%,CD分离株与参考毒株SUN5株的同源性最低,为97.5%,WD分离株与FRA/EPI/Caen/2003/13同源性最低,为97.3%。通过比对可知,分离株与已知毒株之间存在较大差异,为疫苗候选毒株筛选提供依据。本试验同时构建了pET-32a-S1表达载体,在0.2 mmol/L IPTG诱导5 h时,重组菌能在大肠杆菌BL21感受态细胞中产生大量的S1融合蛋白,获得约58 ku表达产物。本试验成功表达了S1蛋白,并对BCoV进行了核苷酸进化分析,为疫苗免疫效果评价方法的建立奠定了基础。     

牛冠状病毒河北流行株部分基因全序列测定及分子特征分析

牛冠状病毒（BCoV）是引起新生犊牛腹泻的重要病原之一,在世界范围内广泛分布,严重影响养牛业的健康发展。为确定河北省BCoV流行毒株的基因遗传进化特征,本研究对从河北省某牛场腹泻犊牛的粪便和肠内容物中鉴定出的1株BCoV流行毒株（BCoV/CH/HB-BD/2019）,进行了S、N、HE基因的全序列扩增及测定,并与GenBank中的51株牛冠状病毒参考株进行了各基因的同源性和遗传进化分析。结果显示：BCoV/CH/HB-BD/2019与BCoV参考株相比,S基因具有2个独特的氨基酸变异位点（N311S、D1276Y）;在HE基因中HB-BD株出现2个独特的氨基酸变异位点,分别为G400V、D423H;虽然在基因的重组分析中,HB-BD株HE基因序列并没有检测到基因重组信号,但通过检测我们发现,HB-BD株HE基因序列为其新疆毒株（KU886219.1）推测的主要亲本毒株;进化分析发现,BCoV HB-BD株与人冠状病毒（HCoV-OC43）均属于β类冠状病毒属2a亚群,且同源性高达96.0%,而正在全世界范围内传播的SARS-CoV-2属于β类冠状病毒属2b亚群病毒,BCoV与SARS...     

新疆南疆牛冠状病毒BCV-Aks-01株分离及基因型鉴定

将疑似感染牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)病死犊牛的粪便样品,滤菌处理后接种于HCT-8细胞,盲传数代,出现细胞病变后收获细胞液。提取病毒RNA,依据NCBI登录的牛冠状病毒高度保守N基因设计1对特异性引物,对N基因进行RT-PCR扩增、测序及序列分析。结果显示,BCV-Aks-01毒株与牛冠状病毒参考株N基因核苷酸同源性为97.5%~98.6%,同BCoV参考毒株Mebus同源性为97.8%,N基因遗传进化树表明,BCV-Aks-01毒株与BCoV参考株亲缘关系较近,处于遗传进化树中同一分支上,属于冠状病毒Betacoronavirus,证实该分离株为牛冠状病毒。     

一株重组犬冠状病毒的鉴定及3′端分子特征分析

为了解犬冠状病毒（CCoV）的基因组特征和遗传变异情况,本试验利用RT-PCR方法从患病犬肠道内容物中鉴定出一株CCoV,命名为BM35。通过RT-PCR方法扩增S、E、M、N和ORF7基因,然后对测序结果拼接并进行系统进化树和遗传重组分析。结果显示：BM35的3′端序列长度为8 870 bp;遗传进化树分析发现BM35与浙江株B639/ZJ/2019、台湾株NTU336、日本株FC1和越南株HCM47处于同一独立分支;重组分析发现BM35与台湾株NTU156和越南株HCM47在S基因发生重组。本研究有助于深入了解国内CCoV流行毒株的分子特性,为后续CCoV诊断试剂和疫苗的开发提供依据。     

牛副流感病毒3型毒株的分离鉴定及基因组遗传变异分析

从新疆地区某牛场出现发热、咳嗽等症状的多例病牛的肺组织中分离得到3株牛副流感病毒3型,分别命名为XJ03、XJ022、XJ023,对其中两株病毒XJ03和XJ023的基因组进行序列测定,测序结果显示,XJ03和XJ023毒株基因组全长分别为15474 bp(Gen Bank登录号为KU198929)和15475 bp,其核苷酸同源性为99.89%。同代表性的牛副流感病毒基因组比对发现,与我国的山东毒株SD0835同源性最高为99.3%,均属C型BPIV。在C型毒株中,与南韩12Q061分离株(C型)同源性最低为97.5%。F、N、HN、L、P、M蛋白基因氨基酸序列分析显示,与SD0835毒株相应序列对比,同源性分别为99.63%、92.15%、99.48%、99.28%、98.50%和100%,部分氨基酸发生了新的变异。试验结果将为今后更好地开展BPIV3防控奠定基础。     

犬冠状病毒的分离鉴定及其纤突蛋白基因的克隆与序列比较

以犬胎原代细胞，采用同步接种、带毒传代和添加新细胞的方法，从１例腹泻犬脾脏和１例临床健康犬肠内容物中分离出２株犬冠状病毒（ＣＣＶＹＳ１，ＣＣＶ ＣＩ１）。该２株病毒可使ＣＲＦＫ细胞出现典型的细胞融合病变，与从美国引进的ＣＣＶＮＬ－１８参考株形成的细胞病变相似；电镜负染和超薄切片观察，分离毒株细胞培养物中均含有典型的冠状病毒粒子，并形成胞浆内包涵体；经理化学、生物学鉴定，濉有ＣＣＶ的特性；间接免疫荧     

麦洼牦牛NOBOX基因克隆与序列分析

为了解牦牛NOBOX基因的特点,根据GenBank中公布的牛NOBOX基因序列设计2对引物,分两段扩增麦洼牦牛的NOBOX基因,然后测序并拼接。序列分析表明,扩增的牦牛NOBOX基因大小为1 975bp,其中开放阅读框全长1 500bp,编码499个氨基酸,分子质量为53.12ku。核苷酸序列同源性分析表明,NOBOX基因具有相对较高的保守性,牦牛与牛的NOBOX基因核苷酸序列同源性很高,为97%。在此基础上,借助Mega 5.0软件,采用N-J算法构建了NOBOX氨基酸的系统进化树,分析了不同物种间的进化关系。牦牛NOBOX基因序列的成功克隆,为麦洼牦牛卵母细胞成熟及早期胚胎发育分子机制的研究及麦洼牦牛的遗传资源保护和育种提供了理论基础。     

牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用多重荧光定量RT-PCR （real-time RT-PCR）方法,提高对多病原检测的速度和灵敏度,促进对犊牛腹泻的快速诊断和及时治疗。分别在牛星状病毒（BAstV）ORF2基因,牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）5'端非编码区,牛冠状病毒（BCV）N pro基因和牛轮状病毒（BRV）VP6基因的保守基因序列设计、合成并试验筛选了四对有效的特异性引物和探针。进一步利用含4种病毒目的片段的重组质粒,对引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,建立了Real-time RT-PCR标准曲线,并对四重Real-time PCR方法的特异性、敏感性、重复性和各种临床样本的适用性进行了评价。结果显示：Real-time RT-PCR最适退火温度和时间分别为50.0℃和45 s,BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的引物浓度分别为300、300、400和500 nmol·L^-1,探针浓度分别为250、150、100和300 nmol·L^-1。对BVDV-1、BCV和BRV的最低检测限均为10²copies·μL^-1,对BAstV的最低检测限为10³ copies·μL^-1,具有良好的特异性和重复性。该方法对临床采集的粪样的阳性检出率高于PCR方法。上述结果表明,建立的四重Real-time RT-PCR方法可以用于犊牛腹泻常见病原BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的快速鉴别诊断。     

牛凸隆病毒HE基因分子特征分析

本研究旨在分析我国牛凸隆病毒(bovine torovirus,BToV)的HE基因分子特征.采用RT-PCR方法检测辽宁、河南、四川的牛腹泻样本中BToV,阳性样本扩增完整HE基因.结果显示:从94份腹泻粪便中检出10份BToV阳性,平均阳性率约为10.64％.从10份阳性样本中扩增得到15条HE基因,其中,9条为基...     

牦牛源链球菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】了解西藏拉萨地区牦牛链球菌的感染情况、致病性及其耐药性,为牦牛源链球菌的研究提供新的数据。【方法】对55份牦牛鼻拭子进行细菌分离培养、菌落形态观察、革兰氏染色镜检、生化鉴定、16S rRNA序列PCR扩增以鉴定分离菌的种属特性。通过人工感染试验小鼠评价分离菌的致病性,采用药敏纸片扩散法检测分离菌的耐药性。【结果】分离菌在血平板上长出灰白色、表面光滑的α溶血圆形菌落,革兰氏染色镜检呈链状排列的阳性球菌。分离菌可发酵葡萄糖、乳糖、海藻糖和山梨醇,不发酵麦芽糖和甘油,硝酸盐还原试验、靛基质试验、V-P试验和MR试验均呈阴性。经16S rRNA基因序列比对分析,确定有25株链球菌(Tibet-1～Tibet-25),检出率为45.46%(25/55),其中17株多动物链球菌,8株马链球菌。分离菌16S rRNA基因序列与NCBI上已发布的链球菌相似性在97.04%～99.77%之间,其中Tibet-1、Tibet-2、Tibet-3、Tibet-5、Tibet-9、Tibet-10、Tibet-11、Tibet-14、Tibet-15、Tibet-16、Tibet-17共11株牦牛源多...     

吉林省肉牛冠状病毒感染状况调查及分析

旨在全面了解牛冠状病毒(BCoV)在吉林省肉牛群的流行情况,选择吉林省东中西部地区的12个县市的规模化、养殖合作社、家庭型养殖户等牛场在不同季节采集血液、鼻拭子、粪拭子及临床病死牛组织脏器,采用血清学及分子生物学诊断检测技术,对BCoV进行流行病学调查,了解BCoV在该吉林省部分地区的流行情况。共采集临床血清样品1 298份,粪便样品、肝、肺、脾、气管等组织样品462份,应用商品化BCoV抗体检测试剂盒检测血清抗体和纳米PCR新型检测技术对临床样品进行PCR检测,并对核酸检测出的阳性结果测序分析。结果显示BCoV抗体血清阳性率为1.08%,粪便、肝等临床样品阳性率21.10%。经测序分析调查地区BCoV流行株与我国四川流行株相似性达99%以上。本研究对吉林省中部地区BCoV流行情况进行了全面调查,丰富了牛冠状病毒的流行病学调查数据,为指导牛冠状病毒的防控工作奠定了基础。