调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4(Tβ4)基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155～-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降(P0.05)。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。     

水貂DCT基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了找到水貂多巴色素异构酶(DCT)基因启动子活性区域及转录因子结合位点,试验采用PCR扩增与克隆,构建双荧光素酶报告基因重组质粒,分别转染到293T细胞和A375细胞,测定其活性,并利用在线软件对序列进行生物信息学分析,预测水貂DCT基因核心启动子区域的转录因子结合位点。结果表明:得到的6个不同长度的启动子片段均具有明显的启动子活性,且-1 292～+113 bp区域活性最高,提示其为水貂DCT基因核心启动子区域;成功筛选出337 bp水貂DCT基因活性较高的启动子片段,发现转录因子特异性蛋白1(Sp1)可能是调控启动子活性的重要转录因子。     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4（Tβ4）基因转录的增强子，探究该基因的表达调控机制，本研究以民猪基因组DNA为模板，通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段，与pMD18-T载体连接构建克隆质粒；通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒；将重组质粒转染PK15细胞系，利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性；根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域；利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点，根据预测结果，使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体，在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明，试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段，其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现，-155~-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域，经生物信息学分析发现，该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体，经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失，会造成启动子活性的显著下降（P<0.05）。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。     

北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

ssc-miR-148a启动子克隆及其特征分析

为研究猪miR-148a(ssc-miR-148a)的转录调控机制,对其启动子进行了克隆及分析。本试验首先设计特异性PCR扩增引物,分别得到ssc-miR-148a前体上游3个片段,并将其连接到荧光素酶报告载体pGL3-Basic上。通过生物信息学方法,在线分析ssc-miR-148a启动子大概区域、甲基化部位和转录因子结合部位。将重组报告质粒转染293T细胞,分析启动子活性。采用不同浓度碱性成纤维生长因子(bFGF)处理猪成纤维细胞和转染有重组报告质粒的猪成纤维细胞,检测ssc-miR-148a和DNA甲基化转移酶1(DNMT1)的表达,及其对启动子活性的影响。结果显示,克隆得到的ssc-miR-148a启动子区2 043bp片段具有启动子活性,该序列存在5个CpG岛、Sp1及AP2等转录因子结合位点。0、5和10ng·mL-1浓度bFGF处理猪成纤维细胞和转染重组报告质粒的猪成纤维细胞后,ssc-miR-148a表达均显著下降(P0.05),DNMT1 mRNA显著增加(P0.05)。启动子活性均显著下降(P0.05),5和10ng·mL-1浓度间无显著差异(P0.05)。结果表明,ssc-miR-148a启动子位于前体上游2 043bp片段内,启动子区域有转录因子SP1结合位点,其表达受bFGF的调控。     

Am80和TSA对鸡Stra8基因启动子活性的调控作用

旨在确定鸡Stra8基因启动子的主要调控区域,预测调控元件结合位点,探索用他米巴洛丁(Am80)或曲古抑菌素(TSA)诱导对Stra8启动子活性的调控作用。将鸡Stra8基因5′侧翼系列缺失片段插入到pGL3-basic载体构建重组质粒,并转染DF-1和GC-1,通过检测荧光素酶活性和预测启动子区域调控元件的结合位点,选取合适的启动子片段并构建其重组质粒Stra8-EGFP;将Am80和TSA分别按一定的浓度梯度诱导转染细胞,进行荧光素酶活性检测以筛选最佳诱导浓度;用最适剂量的Am80和TSA分别单独或联合诱导转染重组质粒Stra8-EGFP的P19,并检测各诱导组的绿色荧光表达程度。结果表明,鸡Stra8基因启动子-1 055~+54bp片段的活性较强,且含有RARα、RXRα和RARβ的结合位点;分别单独或联合使用Am80和TSA对转染的细胞进行诱导,结果显示,Am80和TSA协同作用的荧光素酶活性最高;重组质粒Stra8-EGFP转染细胞后,用Am80(10-5 mol·L-1)和TSA(10-6 mol·L-1)联合诱导可见绿色荧光强度最强。本研究成功分析了鸡Stra8基因启动子的活性和调控元件的结合位点,确定Am80和TSA共同诱导可显著提高Stra8基因启动子调控活性。     

水貂TYRP1基因启动子活性和Sp1结合位点

以同源性较高的雪貂TYRP1基因序列(GenBank:NW_004569257.1)为模板,通过PCR扩增7个不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-Basic载体中,利用脂质体转染到A375和293T细胞,通过双荧光素酶检测系统检测活性,利用多个在线软件分别分析启动子区活性及转录因子结合位点,并构建突变体进行活性验证。结果显示:成功构建7个不同长度的启动子缺失片段重组质粒,其中6个片段具有明显的启动子活性。-367/+70区域为水貂TYRP1基因核心启动子区域,-367/-144区域的缺失,启动子活性无明显变化,-144/-37区域的缺失使启动子活性明显下降,表明该区域可能存在正调控元件。通过生物信息学方法预测可能存在Sp1转录因子结合位点,构建的Mut-Sp1-2突变体活性明显低于野生型pGL3-215,差异极显著(P0.01)。结果表明:成功筛选了水貂TYRP1基因核心启动子区域(-367/+70),确定Sp1(-56/-45)结合位点为转录的正调控区域。     

非繁殖季节补饲精料诱导哈萨克羊发情及相关生殖激素变化规律的探究

为了研究补饲精料诱导非繁殖季节哈萨克母羊发情,解析绵羊非繁殖期发情的生殖激素变化规律,为利用营养因素调控非繁殖季节绵羊发情提供激素方面的理论依据,研究选用成年哈萨克母羊36只,随机分成2组,试验组在2—6月份补饲精料,在非繁殖季节(4—6月份)对发情绵羊及不发情母羊(对照)颈静脉采血,采用酶联免疫法(ELISA)测定外周血液4种重要生殖激素雌二醇(E2)、孕酮(P4)、促卵泡激素(FSH)和促黄体素(LH)的浓度。结果表明:血液中E2和P4呈现波动式变化,FSH和LH呈现规律性脉冲式变化。说明E2和FSH与绵羊的非繁殖季节发情有关,高浓度的P4和LH对开启或维持绵羊的发情有重要作用。     

水牛HSD17B1基因启动子荧光素酶报告基因载体构建与分析

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素，并预测其转录结合因子，为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板，PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列，并定向克隆至pGL3-promoter载体；将重组质粒转染到水牛卵泡颗粒细胞，通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性，并探究其与促黄体素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）的关系；利用生物信息学方法对HSD17B1基因启动子区进行转录结合因子预测。结果显示，本试验成功克隆了3个不同长度的HSD17B1基因启动子片段，并成功构建了双荧光素酶报告载体。经不同长度启动子片段的活性检测发现，pGL-pro-HSD17B1-1500活性最强，证实－866/－1 500 bp为HSD17B1基因核心启动子区域，表明该区域对HSD17B1基因转录调控有重要作用。荧光素酶活性检测结果显示，添加LH可增强HSD17B1基因启动子活性。生物信息学分析发现，HSD17B1基因启动子区存在6个转录因子结合位点：Sp1（－2 327/－2 317 bp）、HOXA4（－2 162/－2 146 bp）、Sp1（－1 409/－1 395 bp）、Sp1（－1 391/－1 380 bp）、Sp1（－1 345/－1 319 bp）和GATA1（－812/－801 bp），但无CpG岛，有1个TATA-box和2个CAAT-box。本研究成功构建了HSD17B1基因启动子荧光素酶报告载体，确定了HSD17B1基因启动子核心区域，并证明LH可增强启动子活性。     

猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究

旨在通过分析猪StAR基因启动子活性区域,探究猪StAR基因的转录调控机制,从育种学角度为提高猪繁殖力提供新思路。本研究根据Ensembl数据库已公布的猪StAR基因的5′侧翼区序列,利用在线预测软件对该基因启动子区序列信息进行分析,以大白猪基因组DNA为模板,利用特异性引物,进行PCR扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-StAR双荧光素酶表达载体,转染293T细胞并进行活性检测。结果显示,StAR基因5′侧翼区不含有典型的TATA-box和CpG岛;成功克隆了10个含有不同长度的启动子片段,并构建了各片段与表达载体的重组质粒;转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测发现,大白猪StAR基因5′侧翼区存在着核心启动子,其中-196~+127bp这一区域活性值最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01),表明在+127~-196bp的区域内存在重要的正调控因素,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。-41~-196bp为核心启动子区域,该区域存在着关键的正调控元件,包含GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16和ZNF740转录因子结合位点。本试验通过对StAR基因进行生物信息学分析,并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了StAR基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性。初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究StAR基因转录调控机制提供理论依据。     

绵羊甘露聚糖结合凝集素基因启动子区的克隆与序列分析

为了探讨绵羊甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin,MBL）基因启动子区活性及转录调控机制,本试验根据已提交的绵羊MBL序列设计3条特异性引物,采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)技术扩增获得绵羊MBL基因的启动子区序列。经生物信息学分析,确定了其转录活性区域,发现绵羊MBL基因启动子无TATA框,但其存在多个PEA3和Spi-1/PU.1转录因子结合位点,二者同属Ets家族,且参与绵羊MBL基因转录起始复合体的形成。此外,该序列还包含Sp1、GATA-1、TCF/LEF等其他转录因子结合位点。结果表明,试验成功克隆获得了绵羊MBL基因的启动子区序列,为后期MBL基因启动子区活性及其表达调控机制和甲基化研究奠定基础     

绵羊生殖激素研究及非繁殖季节的应用

绵羊的一系列繁殖活动都与生殖激素的变化有着密不可分的联系.生殖激素在体内的分泌是受下丘脑-垂体-卵巢轴的调节,下丘脑起主宰作用,但垂体和卵巢分泌的生殖激素是影响繁殖的主导因素,这些内源性的激素主要有促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、孕酮(P)、雌激素(E)等,它们在体内有规律、有节奏的分泌,调控着绵羊的各种繁殖活动.     

蛋鸡胱硫醚β合酶基因启动子鉴定与分析

旨在鉴定胱硫醚β合酶(Cystathionine beta synthase,CBS)基因5′调控区和核心启动子特征,为研究蛋鸡骨骼中该基因的表达调控机制提供依据。采集68周龄罗曼蛋鸡胫骨组织,利用酚-氯仿法提取基因组DNA,以UCSC数据库中CBS基因序列为模板设计5′调控区扩增引物,利用生物信息方法分析5′调控区序列特征并进行转录因子结合位点预测,并构建双荧光素酶报告基因重组载体,通过转染DF-1细胞系后检测双荧光素酶活性,进行CBS基因的核心启动子区鉴定。结果表明,蛋鸡CBS基因5′调控区含有潜在的核心启动子区、典型的CpG岛和多个转录因子Sp1结合位点;不同长度片段均具有启动子活性,但不同片段活性存在显著差异,其中F4片段(-155~+131bp)具有最高的转录活性,确定该片段为核心启动子区。蛋鸡CBS基因5′调控区结构特征与核心启动子的鉴定和转录因子结合位点的发现为研究该基因在骨骼中的表达调控机制奠定了基础。     

催乳激素对山羊脂肪酸合酶基因转录活性的影响

为探讨催乳激素对体外培养的山羊乳腺上皮细胞脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)基因转录活性的调控作用,试验分别用不同浓度的胰岛素(insulin,INS)、雌激素(estradiol,E_2)、催乳素(prolactin,PRL)及不同激素组合(INS+PRL、E_2+INS+PRL)处理山羊乳腺上皮细胞24h,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR检测催乳激素对FASN基因mRNA表达水平的影响。细胞转染山羊FASN基因启动子报告基因载体,同样用不同浓度的胰岛素、雌激素、催乳素及激素组合处理24h,利用双荧光素酶报告基因系统检测催乳激素对FASN基因启动子活性的影响。结果发现,用雌激素、催乳素处理山羊乳腺上皮细胞后,FASN基因启动子活性及mRNA水平极显著或显著上调(P0.01;P0.05),雌激素浓度为10、100μmol/L和催乳素浓度为0.1和1μg/mL时效果最为明显,而胰岛素对FASN基因的启动子活性及mRNA水平没有显著影响(P0.05)。用不同激素组合(INS+PRL、E_2+INS+PRL)处理细胞均能显著上调FASN基因启动子活性及mRNA表达水平(P0.05)。结果表明,雌激素和催乳素能够调控FASN基因的转录活性,为进一步研究泌乳过程中FASN基因的分子调控机制提供理论依据。     

海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca²⁺依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1 009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1 009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1 009 bp的启动子5'端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P < 0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。     

调控民猪ZBED6基因转录元件的筛选与分析

ZBED6是锌指蛋白家族的一员,在胎盘哺乳动物中极其保守,可通过对IGF2的调控参与骨骼肌生长。为进一步探究ZBED6基因自身的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增ZBED6基因启动子区系列截短片段,构建克隆质粒,通过双酶切和连接反应定向连入pGL3-basic载体,利用PK15细胞和双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;利用在线软件预测启动子区的转录因子结合位点,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点,构建突变载体并在PK15细胞中检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明:ZBED6基因启动子区-2053^-1777 bp存在多个转录因子结合位点,尤其是-1808^-1777 bp,该片段缺失造成启动子活性下降(P<0.01);利用在线软件在该区间预测到3个转录因子HINFP、Adf-1和CREB3,经实验验证后发现这3个转录因子均可调控ZBED6基因的转录,其中Adf-1效果最为明显。据此推测,民猪ZBED6基因的转录调控机制较为复杂,其启动子区存在HINFP、Adf-1和CREB3等多个调控元件的结合位点。