牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

旨在筛选牛CART基因核心启动子区并鉴定调控CART表达的转录因子,探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得牛CART启动子序列,EMBOSS、MethPrimer、New PLACE数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的CART启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用DNA pull down结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至293T细胞,分析转录因子对牛CART核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明,牛CART基因-1 200 bp～+22 bp区域存在CpG岛和TATA box、CAAT box等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-292 bp～+22 bp片段转录起始活性最强,为牛CART基因核心启动子区;转录因子RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA可与牛CART基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实RFX5、RFX1、TEA...     

绵羊生殖激素研究及非繁殖季节的应用

绵羊的一系列繁殖活动都与生殖激素的变化有着密不可分的联系.生殖激素在体内的分泌是受下丘脑-垂体-卵巢轴的调节,下丘脑起主宰作用,但垂体和卵巢分泌的生殖激素是影响繁殖的主导因素,这些内源性的激素主要有促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、孕酮(P)、雌激素(E)等,它们在体内有规律、有节奏的分泌,调控着绵羊的各种繁殖活动.     

外源生殖激素调控母猪生殖能力的研究

对注射外源生殖激素对后备母猪、断奶母猪生殖能力的影响进行了探讨、研究。试验选择9月龄健康纯种大白和长白母猪,分析外源生殖激素(或者激素组合)对母猪发情及产仔情况的影响。结果表明,肌肉注射800IU和1000IU绒毛膜促性腺激素(HCG)均能显著提高后备母猪受孕率;肌注孕马血清促性腺激素(PMSG)800IU+HCG400IU可显著提高大白纯种母猪的发情、受孕及产仔率;使用氯前列烯醇(PG)或者与PMSG、HCG组合使用,在发情率和受孕率、产仔数等方面都有较好的效果。研究指出注射外源生殖激素的方法可以有效调控母猪的生殖能力,诱发后备母猪和断奶乏情母猪发情面具有实际应用价值。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

绵羊miR-150靶基因预测及生物信息学分析

为探究miR-150在绵羊卵巢中的调控机制,本研究利用生物信息学方法对miR-150进行靶基因预测与分析。通过miRBase数据库获取miR-150成熟序列,进行序列比对和保守性分析;利用Ensemble数据库搜索miR-150前体序列,并利用PROMO在线软件对其上游2 000 bp的启动子区进行转录因子结合位点预测;通过TargetScan和miRwalk在线软件预测并取靶基因的交集,采用DAVID和KOBAS在线软件对预测靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用Networkanalyst在线软件对靶基因进行功能性蛋白的互作分析,绘制miR-150靶基因参与的调控网络;利用YM500V2在线软件分析miR-150靶基因在不同组织和疾病中的差异表达水平。结果显示,miR-150成熟序列在不同物种间具有高度保守性;miR-150启动子区存在p53、ID1、FOXO4等转录因子结合位点。GO功能分析结果显示,主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程,锌离子结合、DNA结合、转录DNA模板等分子功能,以及核、核质、胞质、胞质核周区域等细胞组分。KEGG通路富集结果显示,主要富集在癌症通路、癌症中蛋白聚糖、人乳头瘤病毒感染、乳腺癌、调节干细胞多能性等信号通路。miR-150靶基因互作分析发现,靶基因PIK3R1、PIK3CB、CTNNB1与其他蛋白存在较多靶向关系,参与了雌激素信号通路、细胞衰老、磷脂酰肌醇信号系统、TGF-β等通路。根据YM500V2在线软件分析miR-150在不同组织和疾病中的表达发现,在血液中表达水平最高,在卵巢、胰腺、淋巴和皮肤中表达水平相对较高,在脑和肾上腺皮质中表达水平很低或不表达。通过对绵羊miR-150靶基因的生物信息学分析,为其功能和调控机制研究提供参考依据,为绵羊miR-150在卵巢发育中的调控机制奠定基础。     

生殖激素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

母羊体内生殖激素在不同季节的分泌水平是不同的,这就说明在不同季节,需要不同的生殖激素浓度刺激,才能使卵母细胞体外成熟效果达到最佳。由于本试验是在夏季绵羊乏情季节进行,所以通过对比FSH、LH和雌激素不同浓度对绵羊卵母细胞的体外成熟影响,期望优化出适合晋中绵羊夏季乏情季节体外成熟培养所需的生殖激素的添加方案,完善乏情季节晋中绵羊卵母细胞体外成熟的体系。     

生殖激素对绵羊繁殖性能影响的研究进展

影响绵羊产业效益的因素中,繁殖性能最为重要。研究发现多种生殖激素可以调控绵羊的繁殖性能。论文综述了促性腺激素释放激素、促卵泡素、促黄体素、孕酮、雌二醇、褪黑激素、促甲状腺素、甲状腺激素这8种激素对绵羊繁殖性能影响的新进展,为生产实践中绵羊繁殖性能的提高提供科学依据和新思路。     

绵羊胚胎移植生殖内分泌调控及其效果研究

初产供体母羊（14月龄）德国美利奴15只、波德代15只、无角陶赛特18只分别用孕酮(CIDR)+促性腺激素(PMSG)+促卵泡素(FSH)进行处理,受体小尾寒羊母羊（2胎）124只用CIDR+PMSG进行处理,处理期测定供、受体外周血液中生殖激素孕酮（p4）、雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）的动态变化。结果显示：3个供体品种和受体各自发情同期化水平和效果达到非常理想的状态,但供、受体发情同步差相距1 d。黄体数德国美利奴（7.71）显著高于陶赛特（5.19）（P<0.05）;冲卵数德国美利奴（5.50）显著高于陶赛特（3.44）（P<0.05）;可用胚胎率德国美利奴、波德代、陶赛特分别为70.13%、55.74%、78.18%,陶赛特显著高于波德代（P<0.05）;德国美利奴、波德代、陶赛特胚胎移植受胎率分别为55.26%、54.17%、42.31%,德国美利奴显著高于陶赛特（P<0.05）。处理期供体和受体生殖激素动态变化的幅度大,第13天供、受体血清中p4达到峰值,小尾寒羊分别高于德国美利奴（5.37 ng/mL）、波德代（6.14 ng/mL）和陶赛特（5.37 ng/mL）;供体血清中E2于第14天开始发情达到峰值,小尾寒羊于第15天开始发情达到峰值;供体血清中FSH于第13天达到峰值,小尾寒羊第14天达到峰值;供体血清中LH于第14天开始发情达到峰值,小尾寒羊血清中LH于第15天开始发情达到峰值。     

鹅p21基因克隆、启动子分析及转录调控研究

【目的】 分析鹅p21基因的结构和启动子活性,探讨p21基因的转录调控机制。【方法】 以泰州鹅为试验对象,通过同源克隆、RACE和生物信息学分析等方法获得鹅p21基因全长序列和5′-侧翼区序列特征;构建6个不同缺失片段的启动子区双荧光素酶报告载体并分析其荧光素酶活性,进而确定p21基因核心启动子区;对核心启动子区转录因子结合位点生肌决定因子(MyoD)(+25~+36 bp)进行定点突变,并构建突变报告基因载体,在C2C12细胞系内初步鉴定鹅p21基因核心转录调控因子。【结果】 鹅p21基因cDNA全长1 943 bp,CDS区大小为453 bp,编码151个氨基酸,蛋白序列包含高度保守的CDI家族结合位点。系统进化树分析表明,鹅p21基因与鸭亲缘关系最近,与鸡和火鸡有较强的进化关系。鹅p21基因5′-侧翼区包含启动子元件,—35~+37 bp是核心启动子区,发挥正向调控作用,结合定点突变技术初步鉴定MyoD是鹅p21基因核心转录调控元件。【结论】 本研究获得了鹅p21基因完整的cDNA序列和启动子区域,MyoD是p21基因核心转录调控因子,为探究p21基因在鹅胚胎期肌肉发育过程中的调控机制提供理论依据。     

母犬发情期生殖激素测定及其意义

本试验从15只处于发情前期母犬中随机选取6只母犬,检测其促黄体生成素(LH)、促卵泡素(FSH)和孕酮(P4)3种激素,实现对母犬发情期连续的监测过程。采用静脉采血,抗凝低温离心后分别测定促黄体生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、孕酮(P4)的含量,促黄体生成素采用人促黄体生成激素放射免疫分析药盒的方法测定,促卵泡素采用人促滤泡激素放射免疫分析药盒的方法测定,孕酮采用孕酮放射免疫分析药盒的方法测定。测定结果显示:母犬发情期的促黄体生成素的变化范围为5.16～6.82 ng/mL(除峰值外),其峰值平均值是116.71ng/mL;母犬发情期的促卵泡素的变化范围为3.18～4.78 ng/mL(除峰值外),其峰值平均值是43.56 ng/mL;母犬发情期的孕酮的变化范围为0.199 1～8.506 3 ng/mL,其峰值平均值是8.506 3 ng/mL。母犬在发情时,可出现LH释放波,并在LH开始释放后24 h内或开始发情的1～2 d内排卵。     

生殖激素对雄性生殖细胞凋亡调控的研究进展

随着工业化生产的不断扩大，由环境内分泌干扰物诱发生殖细胞凋亡的报道日趋增多。因此，激素在生殖细胞凋亡中作用的研究再次成为人们关注的焦点。文章对调节雄性生精活动的主要生殖激素如促黄体素、卵泡刺激素、睾酮等对生殖细胞凋亡的调控进行了综述。目的是为了进一步阐明生殖激素在生殖细胞凋亡过程中的作用机制，为男性不育，生殖系统肿瘤等生殖系统疾病的防治及环境毒物致病机理和药物残留学的研究提供理论基础。     

山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。     

鹅MyoG基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制.本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系.进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF...     

北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

针刺治疗卵巢疾病及对生殖内分泌激素调控的研究进展

针灸学是我国传统中医学的一支奇葩,应用针刺腧穴治疗疾病具有悠久的历史,长期以来积累了丰富的经验.尤其在应用针刺治疗卵巢疾病方面,取得了相当好的效果.近年来,随着对针刺腧穴调控雌性生殖内分泌功能研究的不断深入,在其机理方面的研究,引起了国内外许多专家、学者的广泛关注,也取得了长足进展,现就近年来针刺腧穴治疗卵巢疾病及对雌性生殖内分泌激素调节的研究概况综述如下.     

北极狐MITF-M基因启动子活性及转录调控元件的分析

为了探究MITF-M基因对狐狸毛色的遗传调控机制,利用PCR扩增技术对北极狐MITF-M基因启动子区6个缺失片段(2 279,1 738,1 313,1 040,524和236 bp)进行扩增,利用双荧光素酶报告基因检测技术对该基因启动子表达载体转染细胞(A375和293T)的相对活性进行检测,通过在线软件对核心启动子区转录因子结合位点进行预测,利用重叠延伸PCR和双荧光素酶报告系统检测技术对预测出来的转录因子结合位点进行点突变活性分析。结果表明,北极狐MITF-M基因启动子区524 bp(-510 bp/+13 bp)处活性最高,预测发现-510 bp/-222 bp区域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)转录因子结合位点,这3个转录因子结合位点突变后能使北极狐MITF-M基因的启动子活性上升。综上,北极狐MITF-M基因核心启动子区在-510 bp/-222 bp区域,转录因子结合位点CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)对北极狐MITF-M基因的转录激活起到一定的调控作用。     

水貂DCT基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了找到水貂多巴色素异构酶(DCT)基因启动子活性区域及转录因子结合位点,试验采用PCR扩增与克隆,构建双荧光素酶报告基因重组质粒,分别转染到293T细胞和A375细胞,测定其活性,并利用在线软件对序列进行生物信息学分析,预测水貂DCT基因核心启动子区域的转录因子结合位点。结果表明:得到的6个不同长度的启动子片段均具有明显的启动子活性,且-1 292～+113 bp区域活性最高,提示其为水貂DCT基因核心启动子区域;成功筛选出337 bp水貂DCT基因活性较高的启动子片段,发现转录因子特异性蛋白1(Sp1)可能是调控启动子活性的重要转录因子。     

绵羊繁殖调控的转录组学和蛋白组学研究进展

繁殖性状是绵羊重要的经济性状之一,在绵羊生产中具有显著的经济学意义。随着现代分子生物技术的发展,从基因、蛋白水平研究其调控机理已成为当前该领域的研究热点。文章综述了转录组学和蛋白组学及二者关联分析在绵羊繁殖调控上的应用,并对其应用进行了展望。     

miR-214在绵羊毛囊周期性发育中的调控作用研究

为了探讨miR-214在绵羊毛囊生长发育过程中的调控作用,试验分析了来源于前期转录组测序技术获得的差异性表达的miR-214序列,并采用生物信息学方法预测靶基因,结合GO功能注释和KEGG富集分析对预测的靶基因进行研究。结果表明：miR-214在各物种中高度保守,经在线软件YM500V2预测miR-214主要在皮肤组织高表达,且miR-214在毛囊发育的生长期低表达,休止期高表达。miR-214共靶向到1 045个靶基因,其中26个位于3条毛囊发育相关信号通路WNT、P53、FOXO中。PCK2、CCNB3、SKP2、RRM2、SFN和CCNE2基因的相关系数低于-0.75,且各有3个位于P53和FOXO3信号通路。上述6个靶基因随着毛囊生长阶段的发展呈现规律变化,在生长期高表达,休止期低表达,生长早期再次高表达。说明miR-214可能通过在休止期的高表达导致FOXO、P53、WNT信号通路上靶基因的低表达,以起到重要的调控作用。