CRISPR/Cas9介导敲除小鼠成纤维细胞MMP-2基因

MMP-2与蹄叶炎的发生密切相关。本试验通过http://chopchop.cbu.uib.no/网站设计MMP-2的sgRNA,将sgRNA的合成物连接到经Esp3I限制性内切酶切割的lenticrispr v2载体上,构建完整敲除载体;并将该载体转染到小鼠成纤维细胞中,通过Western Blot检测MMP-2蛋白表达量。经菌液PCR鉴定和PCR产物测序表明载体构建成功;Western Blot结果显示,基因敲除组的MMP-2蛋白表达量明显降低,表明成功敲除小鼠成纤维细胞中MMP-2基因。为进一步在细胞层次研究MMP-2基因对蹄叶炎作用及机理提供了条件。     

CRISPR/Cas9基因敲除研究进展

功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步,基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。基因敲除手段种类繁多,其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术,具有高效、便捷、精确等优点,在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。随着科研工作的逐渐深入,CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用,为科研工作的开展提供参考。     

CRISPR/Cas9介导CPED1基因敲除载体活性的验证

试验旨在利用CRISPR/Cas9技术分别在鸡成纤维细胞DF-1和鸡胚胎干细胞(Em-bryomic stem cell,ESCs)上介导CPED1基因敲除,以期为后续研究CPED1基因功能提供技术依据。克隆CPED1基因全长;构建cas9/g RNA载体并转染DF-1和ESCs,经流式分选阳性细胞,采用T7E1酶切法选择活性最佳的敲除载体并分析其敲除效率;同时,对DF-1中的脱靶效率进行检测。结果成功克隆鸡CPED1基因,并构建3个cas9/g RNA载体;T7E1酶切结果表明cas9/g RNA1载体在DF-1阳性细胞中的敲除活性(37%)最佳,该载体也可定点敲除ESCs中的CPED1基因,敲除活性为25%,且在DF-1细胞中未发生脱靶。表明CRISPR/Cas9可有效介导鸡CPED1基因在DF-1和ESCs上敲除。     

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因敲除的猪回肠上皮（immortal pig intestinal-2I,IPI-2I）细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体（pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5）共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞（片段敲除效率为15.5%）,其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9技术的Wip1基因敲除ST细胞的建立

旨在采用CRISPR/Cas9编辑系统获得Wip1基因敲除的猪睾丸（swine testis,ST）细胞,为后续在细胞水平上探究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响奠定基础。本研究将实验室已有的靶向Wip1基因第一外显子的两条sgRNA（sgWip1-1和sgWip1-2）分别连接到pX330-GFP和pX330-RFP载体,然后共转染ST细胞（从80~90日龄的猪胚胎睾丸组织中分离出未成熟的支持细胞）。利用流式细胞仪收集红绿双荧光阳性的ST细胞,以用于单克隆细胞挑选。对得到的30个单克隆细胞进行基因型鉴定,并将PCR产物进行T-A克隆。结果显示,有29个单克隆细胞出现了基因片段敲除,Wip1基因的片段敲除效率为96.7%。其中单等位基因片段敲除的有5个,纯合双等位基因片段敲除的有8个,杂合双等位基因片段敲除的有16个。本研究高效地构建了Wip1基因敲除的ST细胞,不仅为后续研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响提供了细胞模型,也为研究Wip1基因对公猪繁殖性能的影响奠定了基础。     

CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除

本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据。基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP(chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%。通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除。     

CRISPR/Cas9介导鸡IHH基因载体构建及其敲除效率检测

为了揭示IHH(Indian hedgehog)基因在鸡匍匐性状形成过程中的作用机制,利用在线sgRNA平台设计4条IHH sgRNA序列,构建了sgRNA-PX459表达载体,分别命名为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4。采用脂质体转染至鸡DF-1成纤维细胞后,通过嘌呤霉素筛选4d后收集阳性细胞,采用试剂盒法提取基因组DNA,利用T7E1内切酶和TA克隆测序方法检测4个表达载体的打靶效率。结果表明:4条sgRNA表达载体构建成功,并且都能高效地在DF-1细胞中表达,其中sgRNA1表达载体能有效地打靶IHH基因,通过测序分析发现打靶效率为75.0%,测序结果表明这些突变都以碱基缺失为主。研究结果为揭示IHH基因在鸡匍匐性状中作用机制奠定了坚实的基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Prdx6基因敲除的RAW264.7细胞系

利用CRISPR/Cas9系统构建敲除Prdx6基因的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,为探讨Prdx6与布鲁菌感染及胞内寄生的关系构建细胞模型。针对Prdx6基因的第1外显子设计sgRNA,构建重组表达载体Prdx6-pX459-sgRNA,将重组质粒转染RAW264.7细胞,嘌呤霉素初步筛选。单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。结果表明,在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失,导致移码突变。说明成功获得敲除Prdx6基因的RAW264.7细胞系。     

CRISPR/Cas9系统介导的一步法胚胎注射获得猪GGTA1敲除胚胎

利用CRISPR/Cas9系统介导的一步法注射方式,对猪1-细胞期孤雌胚胎进行注射来获得GGTA1基因敲除胚胎,同时对胚胎发育过程进行跟踪,探索CRISPR/Cas9系统介导猪基因敲除效率和对胚胎发育的影响。结果表明,与对照组相比,利用CRISPR/Cas9系统一步法制备基因敲除胚胎,对卵裂率、囊胚率等胚胎发育指标方面无显著影响;利用T7内切酶I检测发现,GGTA1基因突变率约为28.07%;测序发现,突变类型包括插入型突变以及插入-删除型突变。说明CRISPR/Cas9系统介导的一步法能够高效快速地实现基因敲除且不影响早期胚胎发育。     

靶向敲除猪ApoE基因的CRISPR/Cas9系统构建及基因组检测

通过敲除猪的ApoE基因,为后期构建ApoE缺陷型动物模型奠定基础。利用CRISPR/Cas9系统和实验室前期构建的报告载体,分别构建了靶向猪ApoE基因的两个CRISPR/Cas9表达载体和相应的报告载体。通过CRISPR/Cas9表达载体和RG(Red-GFP)报告载体转染HEK 293T细胞荧光观察结果显示,构建的CRISPR/Cas9表达载体均有较高的活性,进一步在流式细胞仪上检测其活性分别为6.50%和6.83%。将CRISPR/Cas9表达载体和RPG(Red-PuroR-GFP)报告载体转染PK15细胞系,经过嘌呤霉素药物筛选后,对富集到的细胞进行基因组检测。结果显示本系统能够对猪PK15细胞中的ApoE基因进行有效的敲除,其敲除效率分别为40%、53.3%。试验结果可为ApoE敲除猪动物模型的构建提供理论依据。     

基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。该系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统,与TALEN和ZFN技术设计相比更加简单、更容易操作,目前,该技术已成功应用于人类细胞、细菌、斑马鱼、猪、小鼠、食蟹猴以及多种植物的基因组精确修饰,是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。     

CRISPR/Cas9介导的绵羊胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素基因敲除研究

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因突变可引起动物出现"双肌"性状,提高产肉性能。利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除的绵羊胎儿成纤维细胞,为制备MSTN基因敲除羊提供材料。设计构建4个靶向MSTN基因的CRISPR/Cas9载体,脂质体转染细胞后,通过SURVEYOR分析和测序等方法对敲除效率进行检测,采用极限稀释法挑选稳定敲除的细胞系。试验成功构建了4个靶向MSTN基因的CRISPR/Cas9载体,细胞转染后,测序结果显示pX330-target 1和pX330-target 4载体作用的靶位点处出现突变,SURVEYOR分析检测其在靶位点产生切割的效率分别为24.20%和10.18%。通过极限稀释法,获得12个MSTN基因突变的细胞克隆,其中1个为纯合突变。序列比对发现靶位点处有小片段碱基插入或缺失突变,部分会出现移码突变。成功利用CRISPR/Cas9系统实现了绵羊MSTN基因敲除,证明该系统可有效应用于绵羊基因编辑,产生的突变细胞系为制备MSTN基因敲除羊提供了材料。     

CRISPR-Cas9介导的蒙古牛MSTN基因敲除细胞系的建立

试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45 d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞。本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白。试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义。     

非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除技术研究进展

非洲猪瘟(african swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,严重危害着全球养猪业。目前尚无商品化ASFV疫苗用于ASF的防控。传统ASFV疫苗研究存在不同程度的局限性。通过建立ASFV的CRISPR/Cas9基因敲除技术平台,将为非洲猪瘟病毒基因功能研究提供便捷的工具。     

CRISPR-Cas9介导的蒙古牛MSTN基因敲除细胞系的建立

试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞。本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白。试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义。     

CRISPR/Cas9系统在猪基因编辑中的研究进展

随着基因编辑技术不断发展,从最初的同源重组到现在的CRISPR系统,基因编辑的操作步骤得到简化,编辑效率得到提高且降低了成本。CRISPR/Cas9系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑,CRISPR/Cas9技术操作简单、定位准确,近年来被广泛使用。本文主要介绍CRISPR/Cas9系统,并对该系统在猪遗传改良、抗病育种、构建人类疾病模型及异种器官移植4个方面的应用研究进行综述。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除绵羊皮肤成纤维细胞Wnt2基因的研究

为了研究无翅基因相关整合位点2(Wnt2)在绵羊毛囊发育中的作用,通过CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术在绵羊原代皮肤成纤维细胞中敲除Wnt2基因,经T7E1酶切试验进行敲除结果验证,实时荧光定量PCR分析Wnt2、E-钙黏蛋白(CDH1)、半光天冬氨酸酶3(Caspase3)和成纤维细胞生长因子5(FGF5)在敲除后的表达量变化。结果显示:绵羊原代皮肤成纤维细胞中Wnt2基因敲除成功,编辑效率约14.35%;Wnt2相对表达量极显著下调(P0.01),CDH1相对表达量极显著上调(P0.01),Caspase3及FGF5表达上调显著(P0.05)。结果表明:Wnt2基因对毛囊的生长发育具有促进作用。     

鸡Apob基因组织表达与CRISPR/Cas9敲除系统的构建

旨在探究Apob基因在鸡肝脂质代谢过程中的功能.本研究对鸡Apob蛋白进行理化性质分析;利用RT-qPCR检测Apob基因在4周龄黄羽肉鸡组织中的表达情况,每组设置3个重复,进行3次平行试验.根据鸡Apob蛋白关键结构域,在Apob基因外显子设计3对sgRNA,构建Cas/gRNA载体;将重组质粒转染DF-1细胞后,利...     

利用CRISPR/Cas9系统构建TiKi1和TiKi2双基因敲除兔

Tiki基因为新发现的基因,在蛙上的功能研究证实Tiki在头部诱导的过程中起着决定性的作用。由于TiKi基因包含TiKi2和TiKi1两种类型,因此建立一种同时敲除TiKi2和TiKi1两种基因的兔模型,能更好地研究TiKi基因是否影响兔头部的早期发育。本研究通过CRISPR/Cas9系统结合原核期受精卵RNA胞质内显微注射来建立家兔双基因打靶技术体系。考虑到TiKi1和TiKi2的同源性比较高,可能相互之间存在补偿效应,于是设计了一个gRNA能同时靶向TiKi1和TiKi2。将200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA注射到51个处于原核期的家兔受精卵的胞质内,移植到6只受体兔体内,共计生出12只仔兔,经测序鉴定其中有1只仔兔为TiKi1和TiKi2双等位基因敲除模型。结果表明CRISPR/Cas9系统对于家兔双基因修饰研究是一种高效和简便的工具,成功建立的TiKi1和TiKi2双基因敲除兔模型在评估新药疗效、基因治疗等的研究领域中将具有很大的应用潜力。     

CRISPR/Cas9系统敲除山羊CDK2基因载体构建及转染效率检测

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)是细胞通过和进入S期所必须的细胞周期调节激酶,与许多癌细胞的生长有关。然而,目前在山羊上关于CDK2基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。研究采用CRISPR/cas9系统,首先设计CDK2基因的sgRNA片段,在合成CDK2 sgRNA核苷酸序列后,构建能够同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-CDK2 sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对转化子进行验证,最后转染HEK293T细胞,检测细胞荧光和细胞增殖。酶切和测序结果证明,CDK2基因敲除载体构建正确;荧光显微镜检测显示,细胞转染效率在75%以上;细胞增殖检测表明,山羊CDK2敲除质粒不会对人源细胞增殖产生影响。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续获得山羊CDK2基因缺失型细胞系,研究支原体肺炎感染引发的细胞凋亡分子机制提供理论依据。