野生型非洲猪瘟病毒多重数字PCR方法的建立

为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为10² copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵...     

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。     

猪瘟病毒微滴式数字PCR方法的建立

为建立猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,实现猪瘟病毒定量检测.本研究根据猪瘟病毒5'UTR基因的保守序列设计了引物探针,对反应条件进行了优化,同时对该方法的灵敏性、特异性、重复性进行了评估,并对临床样品进行了检测.结果 显示:本方法的最低检测下限为3.2 copies/μL,未发现与其他病毒有交叉反应,样本重复的变异系数为...     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法

试验旨在建立一种非洲猪瘟病毒（ASFV）的荧光定量PCR检测方法,根据ASFV P72基因核苷酸序列,通过基因克隆技术在质粒载体中克隆一段ASFV P72基因片段,设计一对特异性引物以及探针,通过带有基因序列的重组质粒绘制曲线,构建了一种ASFV荧光定量PCR检测手段。结果显示,该方法具有较高的敏感度,标准曲线线性关系较好,相关系数达到0.999 8,重复性较佳,变异系数小;且以其他疾病核酸为模板均未出现扩增曲线,特异性较好。研究表明,该荧光定量PCR方法能够为ASFV的检测提供帮助。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟病毒p54蛋白在病毒感染与增殖过程中起重要作用.根据p54基因的核苷酸序列,设计并合成引物和用6-carboxy-fluorescein (6-FAM) 和tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) 荧光素标记Taq Man双水解探针,以构建的含p54基因的pET-p54重组质粒作为阳性模板,建立了ASFV检测的荧光定量PCR方法(已申请专利,专利号200910067620.6).结果表明,所建立的方法与含p54基因的模板质粒数呈现很好的相关性(R2=0.991),可检测出低于15个拷贝/μL的样品,灵敏度和特异性高,可作为出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测方法.     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、Mg^2＋浓度和引物、探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60 ℃,Mg^2＋终浓度为4 mmol/L,引物、探针终浓度分别为0.8、0.3 μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝/μL的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。     

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的建立

依据非洲猪瘟病毒(ASFV)的vp73基因保守序列,设计了特异性引物与TaqMan探针,扩增片段69bp,建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对,结果显示,本文建立的方法与OIE两种检测方法的特异性相当,灵敏度与OIE荧光PCR方法相当,但比普通PCR方法高出至少10倍。标准定量曲线显示,本文方法最低检测限可达10 copies/μL病毒DNA(相关系数为0.993046)。重复性试验的批内CV值为0.61%～1.14%,批间CV值为1.37%～3.14%,表明本文方法的重复性和稳定性良好。可见,本文建立的基于vp73基因的ASFV实时荧光PCR检测方法具备快速、准确、灵敏的特点,将为检验检疫部门防御ASFV传入我国提供更多技术支持。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法建立

为建立一种快速、准确的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,以2018年8月分离的SY18毒株P72基因序列(GenBank登录号:MH713612.1)为参考毒株,人工合成质粒标准品,命名为pcDNA3-P72,基于该毒株P72基因序列,在1627~1876 bp处设计一对特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系及条件,本研究成功建立了基于P72基因的TaqMan探针qPCR方法,并与OIE的特异性引物和TaqMan探针进行灵敏度、稳定性和特异性比较.结果显示:本研究建立的qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R^2值可达到0.9932,灵敏性最低能检测到10 copies/μL,与OIE引物扩增灵敏度相当,比普通PCR方法高100倍.该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%.这一方法为我国非洲猪瘟疫情的快速确诊提供了必要的分子诊断工具.     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列,设计了一对特异性引物和探针,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法。结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性。     

布氏杆菌微滴数字PCR方法的建立

为建立一种布氏杆菌微滴数字PCR qPCR方法,对布氏杆菌病的定量诊断提供技术支持,在实时荧光PCR (qPCR)检测方法(T/CVMA 20-2020)的基础上,建立了布氏杆菌微滴数字PCR方法,并对方法的反应条件进行了优化,同时对其敏感性、特异性、重复性进行了评估.结果 显示:本方法的最低检测下限为2.6 copi...     

蜜蜂幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR检测方法的建立

为建立新型高灵敏度的幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,针对幼虫芽孢杆菌16S rRNA基因设计特异性引物和探针。通过对反应体系优化,建立幼虫芽孢杆菌ddPCR检测方法,并对方法的灵敏度、线性关系、特异性及重复性进行评估。结果:建立的方法与其他6株非幼虫芽孢杆菌无交叉反应,具有良好的特异性;线性关系良好(R^2=0. 991 4);灵敏度为2. 9 copies/μL; ddPCR检测的相对标准偏差(RSD)在0. 93%～5. 27%,重复性好。试验表明本研究建立的ddPCR方法可以对幼虫芽孢杆菌进行绝对定量检测。     

非洲猪瘟病毒微芯片荧光PCR快速检测技术的建立及初步应用

非洲猪瘟缺乏安全有效的疫苗,其防控有赖于及时、准确的诊断和消毒灭源.本研究在对非洲猪瘟病毒(Afri-can swine fever virus,ASFV)B646L基因序列进行分析的基础上设计引物、探针,建立了基于微芯片的ASFV免提取荧光PCR检测技术.特异性试验结果显示,微芯片PCR可用于我国不同地区ASFV毒株...     

非洲猪瘟常态下猪的日粮营养与饲料安全

随着非洲猪瘟疫情的暴发,我国的生猪养殖业遭受了前所未有的毁灭性打击,使得中国猪肉的自给能力也面临着巨大的威胁与挑战。由于非洲猪瘟病毒结构的复杂性,安全有效的疫苗开发道路也是曲折且漫长。对此,文章主要围绕母仔猪的日粮营养和饲料安全两方面展开讨论,旨在浅析非洲猪瘟常态下,如何维持和提高猪场的稳定与发展,促进我国养猪生产水平的迅速恢复与猪肉供给能力,稳定终端消费市场。     

非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因的核苷酸序列,设计并合成引物以及荧光标记的TaqMan探针,以含P72基因的重组质粒作为阳性模板,用于常规PCR和Real-time PCR方法的建立,结果表明常规PCR的检测灵敏度是600个拷贝的病毒核酸分子,Real-time PCR的检测灵敏度是20个拷贝的病毒核酸分子,两种PCR检测方法均具有特异性强、简单快速的优点。可以用于出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

非洲猪瘟的诊断与防控措施

非洲猪瘟是养猪业的第一杀手,自1921年东非国家肯尼亚首先出现非洲猪瘟疫情以来,这个病毒已经在非洲亚洲欧洲等区域传播了近百年,对世界养猪业造成了无可估量的损失。我国于2018年8月在辽宁省沈阳市首次发生非洲猪瘟疫情,并在极短的时间内传遍全国,对我国养猪行业的发展产生了巨大的影响,养猪业在近2年时间里发生了极大的变化。文章采用TaqMan探针实时荧光PCR技术,阐述一种快速、准确的非洲猪瘟病毒检测方法,并结合非洲猪瘟传播感染途径的特点,制定科学的诊断程序与防控措施来保证养猪业的生产安全。     

Development of a ladder-shape melting temperature isothermal amplification (LMTIA) assay for detection of African swine fever virus (ASFV)

BackgroundDue to the unavailability of an effective vaccine or antiviral drug against the African swine fever virus (ASFV), rapid diagnosis methods are needed to prevent highly contagious African swine fever.ObjectivesThe objective of this study was to establish the ladder-shape melting temperature isothermal amplification (LMTIA) assay for the detection of ASFV.MethodsLMTIA primers were designed with the p72 gene of ASFV as the target, and plasmid pUC57 was used to clone the gene. The LMTIA reaction system was optimized with the plasmid as the positive control, and the performance of the LMTIA assay was compared with that of the commercial real-time polymerase chain reaction (PCR) kit in terms of sensitivity and detection rate using 200 serum samples.ResultsOur results showed that the LMTIA assay could detect the 10⁴ dilution of DNA extracted from the positive reference serum sample, which was the same as that of the commercial real-time PCR kit. The coincidence rate between the two assays was 100%.ConclusionsThe LMTIA assay had high sensitivity, good detection, and simple operation. Thus, it is suitable for facilitating preliminary and cost-effective surveillance for the prevention and control of ASFV.