山羊子宫内膜上皮细胞转染pCI-neo-hTERT质粒后的永生化

为获得大量的、具有高度同一性和表型功能正常的山羊子宫内膜上皮细胞(EEC),本试验将含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达质粒pCI-neo-hT ERT导入原代山羊EEC中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定,利用免疫细胞化学方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈明显铺路石状,与原代细胞形态一致,具有接触抑制性;角蛋白检测阳性;细胞具有较高的端粒酶活性,目前已传至50代仍稳定增殖;100nmol/L的雌二醇(E2)可促进该细胞的增殖;50,100nmol/L的孕酮(P4)可明显抑制该细胞的增殖。这表明hTERT导入山羊EEC后,可使其重建端粒酶活性,从而获得大量的、具有高度同一性和表型正常的细胞。     

山羊子宫内膜上皮细胞转染pCI—neo—hTERT质粒后的永生化

为获得大量的、具有高度同一性和表型功能正常的山羊子宫内膜上皮细胞（EEC）,本试验将含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达质粒pCI—neo—hTERT导入原代山羊EEC中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定,利用免疫细胞化学方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈明显铺路石状。与原代细胞形态一致,具有接触抑制性;角蛋白检测阳性;细胞具有较高的端粒酶活性,目前已传至50代仍稳定增殖;100nmol／L的雌二醇（E2）可促进该细胞的增殖;50,100nmol／L的孕酮（P4）可明显抑制该细胞的增殖。这表明hTERT导入山羊EEC后,可使其重建端粒酶活性,从而获得大量的、具有高度同一性和表型正常的细胞。     

蒙古马胎儿成纤维细胞永生化细胞体系建立的研究

【目的】试验旨在建立永生化蒙古马胎儿成纤维细胞(equine fetal fibroblasts, EFFs)系,为马繁殖与发育生物学研究提供参考。【方法】采用1 mg/mL胶原酶Ⅳ消化分离原代EFFs,利用表达人端粒酶逆转录亚基(hTERT)和潮霉素B抗性的pLV-hTERT-IRES-hygro慢病毒感染EFFs,经潮霉素B筛选得到阳性细胞hTERT-EFFs,以第3代EFFs为对照,采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA的表达水平,CCK-8法绘制生长曲线检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。使用DNAMAN软件比对分析人、马、小鼠、牛、绵羊、猪多物种TERT核苷酸、蛋白和端粒酶RNA组分(TERC)序列相似性。【结果】原代EFFs在实验室培养体系下可传至17代,但第17代细胞发生了衰老。hTERT基因可成功转入EFFs,并至少稳定表达20代。然而hTERT-EFFs增殖能力显著低于EFFs(P<0.05),hTERT-EFFs凋亡早期细胞率显著高于EFFs(P<0.05)。细胞衰老检测结果表明,hTERT-EFFs...     

绵羊附睾褪黑素受体1的表达与定位

为研究褪黑素受体1(MT1)在不同年龄绵羊附睾中的表达模式,选用幼龄绵羊(2~3月龄)、青年绵羊(6~8月龄)和成年绵羊(2~3岁)的附睾,采用实时荧光定量PCR和免疫组化技术检测不同年龄绵羊附睾各部位MT1基因mRNA的表达量和MT1的分布情况。结果表明:幼龄绵羊附睾尾MT1基因的转录水平极显著高于附睾头和附睾体(P0.01);青年绵羊附睾体和附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头(P0.05);成年绵羊附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头和附睾体(P0.05),附睾各部位MT1基因的转录水平随年龄增长呈明显降低趋势;定位结果显示,MT1在各年龄组绵羊附睾的各个部位均有分布,且主要分布在附睾上皮细胞中。综合上述结果,不同年龄绵羊附睾的不同部位均有MT1表达和分布,并随年龄增长各部位的表达量降低,相同年龄绵羊附睾尾MT1的表达水平较高。     

端粒酶基因转染猪气管黏膜上皮细胞增殖特性的研究

为了研究外源性端粒酶(hTERT)基因导入后对原代培养猪气管黏膜上皮细胞(STECs)增殖活性的影响,试验将外源性hTERT基因转染至原代分离培养的STECs中,以脂质体法用重组质粒pCI-neo-hTERT转染STECs;通过倒置显微镜观察细胞形态,间接免疫荧光法鉴定8型角蛋白的上皮源性;用PCR和Western-blot法检测转染后STECs中hTERT基因的表达情况;用MTT法和流式细胞仪分别检测转染细胞的活力和增殖周期。结果表明:脂质体和质粒体积比会影响转染效率,当二者比例为1∶3时,转染效率最佳;转染细胞经PCR扩增得到大小为461 bp的片段,Western-blot检测得到大小为125 ku的条带;转染后的细胞仍然符合上皮源性细胞的生长特点;细胞活力曲线显示,在接种后的第3～5天细胞增殖速度最快;细胞周期测定显示,转染细胞的细胞核型为2倍体,S期细胞达到48.35%。说明原代培养的STECs转染外源性hTERT基因后,细胞增殖活性增高,并保持了基本的细胞生物学特征,有进一步建立稳定传代细胞系的可能。     

永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系的建立

[目的]建立永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系,为基础研究和动物病毒的研究提供稳定的体外细胞模型。[方法]采用组织块贴壁法培养绵羊瘤胃成纤维细胞（ovine ruminal fibroblasts cells,ORFCs）,利用PEI试剂将带有hTERT基因的pCI-neo-hTERT质粒转染ORFCs,经G418筛选得到阳性克隆细胞。采用RT-PCR、Western Blot检测F₁₅和F₃₅代阳性克隆细胞的hTERT基因的转录和表达情况;利用血球计数法绘制原代ORFCs和F₃₅代阳性克隆细胞的生长曲线比较其增殖能力。[结果]将hTERT基因成功转入ORFCs并稳定表达;阳性克隆细胞的增殖能力显著高于原代ORFCs。[结论]该试验成功建立了永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系。     

原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示：组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5～7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18 (CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细...     

雄激素受体基因在绵羊公羔不同组织中的表达特性及性腺中的定位

旨在研究雄激素受体(Androgen receptors,ARs)基因在绵羊公羔不同组织中的表达特性及在性腺中的定位。本研究以QRT-PCR法检测各组织ARmRNA表达规律,免疫组化技术对睾丸和附睾中AR进行定位分析,蛋白质印迹技术对AR蛋白表达量进行定性研究。结果显示:(1)AR在不同组织中均有不同程度的表达,其中在睾丸和心脏中大量表达;(2)在附睾头、体、尾部单层柱状上皮细胞和间质细胞中检测到较弱的阳性信号;睾丸组织间质细胞、精原细胞、管周肌样细胞检测到强阳性信号。综上表明:AR在绵羊不同组织中广泛表达,AR在性腺的发育和精子的成熟过程以及对心脏的保护方面发挥重要作用,其作用机制需进一步研究。     

RBP4基因在绵羊性成熟前后附睾中表达的研究

试验旨在研究视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4,RBP4)基因在绵羊性成熟前和性成熟后附睾中的表达水平,探讨其在绵羊生殖机能调控方面的作用。以绵羊性成熟前和性成熟后附睾为材料,采用实时荧光定量PCR方法检测RBP4基因mRNA在绵羊性成熟前、后附睾中表达量的差异,采用免疫组化技术检测RBP4基因在绵羊性成熟前、后附睾头和附睾尾中蛋白的表达水平。结果显示,RBP4基因在绵羊附睾中性成熟前的表达量为1.3368,性成熟后的表达量为0.6450,虽然二者间的表达量差异不显著(P0.05),但性成熟前的表达量高于性成熟后的表达量。RBP4蛋白在性成熟前、后附睾头上皮层、平滑肌层、组织间质中均有阳性表达,主要位于上皮细胞质、平滑肌细胞质;在附睾尾上皮层、组织间质中有阳性表达,主要位于上皮细胞质。推测RBP4基因可能与附睾主细胞分泌功能和附睾头处的收缩功能有关,预示RBP4可能参与附睾微环境的调控,有利于精子成熟、运动和储存。     

瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响

试验旨在明确瘦素在妊娠和非妊娠绵羊子宫内膜组织中的定位特征,探究其对绵羊子宫内膜上皮细胞中胚胎附植的影响。使用免疫组化法检测瘦素及其受体在妊娠和未妊娠绵羊的子宫内膜上皮组织的表达及定位;利用组织块分离培养原代绵羊子宫内膜上皮细胞,CCK8法确定瘦素最适浓度,RT-qPCR和Western blot检测瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞凋亡的作用,细胞划痕试验检测瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞迁移的作用,RT-qPCR检测瘦素对胚胎附植相关因子血管内皮生长因子（VEGF）、白血病抑制因子（LIF）、白细胞介素-6(IL-6)、子宫内膜附植位点黏蛋白（Muc1）、基质金属蛋白9(MMP9)、白细胞介素-1β(IL-1β)、骨桥蛋白（OPN）、泛素样修饰因子（ISG15）等基因mRNA的表达情况。结果显示,瘦素蛋白主要表达在未妊娠绵羊子宫内膜的基质和上皮组织中,主要在妊娠绵羊子宫内膜上皮组织中表达,瘦素受体表达无明显变化;组织块法可成功获得具有典型上皮样细胞特征并表达角蛋白CK18的原代绵羊子宫内膜上皮细胞。250 mg/L瘦素促进绵羊子宫内膜上皮细胞增殖和迁移,并显著上调Bcl-2,下调BAX、Cas...     

绒山羊附睾上皮细胞培养方法的建立及其生长特性

本研究旨在建立一种简单易行、获取细胞纯度高的绒山羊附睾上皮细胞体外培养体系。10~12月龄绒山羊附睾头部分别采用酶消化法和改良组织块消化法进行原代培养,利用免疫细胞化学染色法和免疫荧光化学法对细胞进行鉴定,同时利用流式细胞仪和CCK法分别检测细胞纯度和增殖情况,在电镜下观察细胞超微结构。结果表明,两种培养方法所获的细胞均呈岛屿状克隆生长和较好的增殖能力,具有活跃的分泌和代谢功能;上皮细胞特异性的角蛋白18和附睾特异性的谷胱甘肽过氧化物酶5(GPx5)的表达以及流式细胞仪结果显示,两种方法所获细胞均为纯度较高的附睾上皮细胞,但改良组织块消化法获得原代细胞需要的时间长,酶消化法获得原代细胞时间短,获得的细胞量大。本研究结果为进一步研究绒山羊附睾上皮功能提供了良好的基础。     

稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。     

低氧诱导因子-1α对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响

本研究旨在探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。首先对牦牛肾小管上皮细胞进行培养鉴定,并选取第三代细胞对其分别进行药物处理(DMOG组)和不做药物处理(对照组),检测EMT相关基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,并观察细胞形态变化。结果表明:使用Ⅰ+Ⅱ型胶原酶可以更好地获得肾小管上皮细胞;免疫荧光结果细胞CK18表达呈阳性,Vimentin和CD31呈阴性表达;qRT-PCR和Western blot结果表明,DMOG组中的HIF-1α,TGF-β1,α-SMA在mRNA和蛋白水平均较对照组有极显著增加(P0.01),而E-cadherin的表达显著降低(P0.05);经药物干预后,细胞形态由铺路石样转变为长梭形,经鉴定长梭形细胞为间质细胞。本研究成功建立了牦牛肾小管上皮细胞的分离培养体系,并发现HIF-1α表达上调可以促进牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化。     

绵羊附睾褪黑素受体1的表达与定位

为研究褪黑素受体1（MT1）在不同年龄绵羊附睾中的表达模式，选用幼龄绵羊（2~3月龄）、青年绵羊（6~8月龄）和成年绵羊（2~3岁）的附睾，采用实时荧光定量PCR和免疫组化技术检测不同年龄绵羊附睾各部位MT1基因mRNA的表达量和MT1的分布情况。结果表明：幼龄绵羊附睾尾MT1基因的转录水平极显著高于附睾头和附睾体（P<0.01）；青年绵羊附睾体和附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头（P<0.05）；成年绵羊附睾尾MT1基因的转录水平显著高于附睾头和附睾体（P<0.05），附睾各部位MT1基因的转录水平随年龄增长呈明显降低趋势；定位结果显示，MT1在各年龄组绵羊附睾的各个部位均有分布，且主要分布在附睾上皮细胞中。综合上述结果，不同年龄绵羊附睾的不同部位均有MT1表达和分布，并随年龄增长各部位的表达量降低，相同年龄绵羊附睾尾MT1的表达水平较高。     

敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQLE)基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降(P0.05),细胞增殖受到极显著抑制(P0.01);G1期细胞数量显著下降(P0.05),G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升(P0.05);肿瘤坏死因子超家族成员6(又称Fas或CD5)的相对表达量显著上升(P0.05),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27)相对表达量显著上升(P0.05),而细胞周期素D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤因子2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax)显著下降(P0.05)。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。     

SV40T基因对绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞体外增殖的影响

本研究旨在通过SV40T基因导入来提高绵羊的子宫内膜上皮细胞(EECs)和基质细胞(ESCs)的体外传代次数,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究奠定基础。采用酶促分离获得原代绵羊EECs和ESCs,并用携带SV40T基因的慢病毒以MOI 1:10和MOI 1:50感染并进行单克隆细胞株筛选。结果表明,所得EECs和ESCs分别具有上皮和基质细胞典型特征(上皮细胞呈铺路石状,基质细胞呈梭形)并表达特异性标记蛋白细胞角蛋白(Cytokeratin)和波形蛋白(Vimentin);EECs传至约50代,ESCs传至约30代后,光学形态观察、SV40T基因表达、标记蛋白免疫荧光及血清依赖性检测结果表明两类细胞形态未发生变化,均表达SV40T基因,并具有上皮细胞特性和基质细胞特性,伴有较强的血清依赖性,证实成功建立了EECs和ESCs细胞株;生长曲线和SV40T基因拷贝数检测结果显示ESCs的增殖能力要强于EECs,MOI 1:10和MOI 1:50感染下,SV40T基因拷贝数差异不显著。以上结果提示,SV40T基因能够大大增强绵羊EECs和ESCs体外增殖能力并延长其寿命,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究提供了素材。     

人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原永生化猪脐静脉血管内皮细胞

为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆,并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征,并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT、CD31和CD34,并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型并对CSFV敏感。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT,SUVEC已被永生化,并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。     

牦牛乳腺上皮细胞体外培养及鉴定

本研究旨在建立牦牛乳腺上皮细胞系,并对建立的细胞系生物学特性进行鉴定,采用组织块种植法,分离培养乳腺上皮细胞;通过胰酶消化法纯化细胞;利用免疫荧光及Western blot技术对其进行鉴定;脂质体介导法将绿色荧光蛋白基因转染进乳腺上皮细胞中,荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白基因表达;金黄色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮细胞,流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测乳腺上皮细胞的凋亡,RT-PCR检测感染细胞中抗菌肽以及凋亡因子表达。结果表明,分离纯化获得牦牛乳腺上皮细胞,细胞角蛋白18表达呈阳性,波形蛋白表达呈阴性,证明培养的细胞是上皮细胞并且没有成纤维细胞污染;β-酪蛋白表达呈阳性,说明建立的乳腺上皮细胞具有一定的泌乳功能;荧光显微镜能够检测到绿色荧光蛋白表达,表明EGFP基因成功导入了乳腺上皮细胞;金黄色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮细胞3h后,Annexin V/PI双染法检测发现感染组细胞凋亡率明显升高,差异显著(P0.05);感染细胞中TAP(P0.01)、BNBD5(P0.01)及BAX(P0.01)表达量明显增高,BCL-2(P0.05)表达量降低。综上表明,本研究成功建立了一株稳定的牦牛乳腺上皮细胞系,该细胞系能够作为研究牦牛乳腺发育及分化的体外研究模型。     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系的建立

为了建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为良好的体外研究模型,本试验取蒙古绵羊输卵管,运用0.25%胰蛋白酶消化的方法分离上皮细胞进行体外培养.对培养细胞进行形态学、免疫组织化学方法鉴定.原代培养细胞用胰蛋白酶/EDTA方法成功传代,传三代后检测其染色体核型.结果显示,成功获得了原代和传代培养细胞,经鉴定为上皮细胞,传三代后经染色体核型分析显示细胞核型正常,培养的细胞健康状况良好,可以用做体外研究模型.     

miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖和分化调节作用的研究

旨在研究miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖与分化的调节作用。本研究经理论预测和试验研究验证miR-128-1-5p的靶基因;过表达miR-128-1-5p后,用qPCR检测增殖标志基因的表达,CCK-8和EdU检测细胞增殖情况;用qPCR和Western blotting检测miR-128-1-5p和其靶基因在前体脂肪细胞分化中的表达趋势;通过过表达或抑制miR-128-1-5p研究其对绵羊前体脂肪细胞分化的调节机制;用油红O染色检测成脂能力。结果表明,KLF2是miR-128-1-5p的靶基因。前体脂肪细胞增殖过程中,过表达miR-128-1-5p后,增殖标志基因的表达量显著或极显著降低(P0.05或P0.01),细胞活力显著或极显著降低(P0.05或P0.01),新生细胞数显著减少(P0.05)。前体脂肪细胞分化过程中,miR-128-1-5p与KLF2的表达呈负相关;过表达miR-128-1-5p极显著下调了KLF2 mRNA的表达量(P0.01),显著下调了KLF2蛋白的表达量(P0.05),显著或极显著上调了分化标志基因mRNA的表达(P0.05或P0.01),产生更多脂滴;抑制miR-128-1-5p则结果相反。综上所述,miR-128-1-5p与KLF2存在结合位点。miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞的增殖,在分化过程中通过靶向抑制KLF2的表达,促进前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。