哺乳动物的精子获能及其鉴定

精子获能是精卵结合的前提,是哺乳动物受精过程中的关键环节。精子获能的发现促使体外授精研究取得了突破性进展,为人类研究受精机理奠定了基础。本文从体内、体外两方面论述了哺乳动物精子获能的培养方法,并且对精子获能的评价方法进行了综述。     

哺乳动物精子获能的分子机制

精子获能是精子能够与卵母细胞发生顶体反应和受精的一个重要生理前提。精子获能的分子机制相当复杂,许多报道表明精子获能受到多种细胞信号途径的调控。尽管目前尚未完全明确,但是许多研究表明获能精子发生许多结构和生化变化,包括蛋白酪氨酸磷酸化、精子膜胆固醇外流、活性氧的产生及精子膜超极化,这些变化都有助于精子获能的发生。Ca2 和HCO3-通过对cAMP的调控有助于获能完成,葡萄糖、孕酮和肝素作为获能液的重要添加物,通过不同途径促发精子获能。文章从这些方面对获能做一综述,在此基础上提出以后的研究方向。     

影响哺乳动物精子体外获能的因素

精子的体外获能是哺乳动物体外受精技术中的关键环节之一。笔者阐述了温度、培养液的pH值、渗透压、动物的种类及培养液的组成对精子体外获能的影响。     

诱导牛精子体外获能的培养基及方法

用去透明带金黄地鼠异种精子体外穿透试验,检测冻精复苏经各种处理后的精子穿卵率。发现在４种基本培养基（ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ、ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ－１６４０）中不加亚牛磺酸时,牛精子不能耐受较高浓度（４μｍｏｌ／Ｌ）钙离子载体（ＩＡ）的刺激（以１０ｍｉｎ计）;而低浓度ＩＡ（低于４μｍｏｌ／Ｌ）处理精子不能诱导获能。生物活性物质,如肝素、咖啡因、亚牛磺酸、肾上腺素单独或联合低浓度ＩＡ处理精子,短期（６ｈ）内也不能诱导获能。当基本培养基中含有亚牛磺酸时,牛精子能耐受高浓度ＩＡ（１０μｍｏｌ／Ｌ）的刺激,并使牛精子获能;亚牛磺酸与肾上腺素、咖啡因联合使用,并在获能液中添加透明质酸酶时,穿卵率进一步提高,获能效果显著改善。以ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ１６４０为主的混合培养基,在牛精子的存活时间、穿卵率等方面优于ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ培养基。结果表明,用Ｆ１０和１６４０的混合培养基,添加亚牛磺酸、肾上腺素、咖啡因、透明质酸酶,经１０μｍｏｌ／ＬＩＡ处理牛精子１０～１５ｍｉｎ,是快速诱导牛精子体外获能的有效方法     

不同获能条件对猪精子体外获能和体外受精的影响

探讨猪精子在mTBM和TALP中分别获能2、3、4、5h和6h对体外获能的影响,并研究最适获能时间的精子体外受精的效果。结果表明:随着获能时间的延长,猪精子顶体反应率逐渐升高、质膜完整性逐渐下降,获能6h时的顶体反应率显著高于其他时间组,分别为52.5%和50.8%(P<0.05);质膜完整性显著低于其他时间组,分别为30.5%和31.4%(P<0.05);可获能4h的超激活运动率显著高于其他时间组,分别为56.6%和54.5%。将鲜精与冻融的精子获能4h后与成熟的猪卵母细胞进行体外受精,mTBM处理组的卵裂率显著高于TALP,分别为42.7%与40.2%和35.9%与33.4%,但鲜精与冷冻精液组间差异不显著。     

Cyclic AMP Signalling During Mammalian Sperm Capacitation – Still Largely Terra Incognita

Cyclic AMP is known to play a major role in intracellular signalling during mammalian sperm capacitation. However, despite much research, many of the molecular details of cyclic AMP's involvement remain obscure. In this review, I discuss the following aspects, presenting some original data as illustration where relevant. With respect to cyclic AMP synthesis, uncertainties exist as to the number of forms of adenylyl cyclase that are present in the spermatozoon, whether they are cytosolic or bound to subcellular structures, and which physiological effectors they respond to (e.g. bicarbonate, Ca²⁺, or receptor‐coupled G‐proteins). While net intracellular levels of cyclic AMP in spermatozoa depend upon the relative activities of adenylyl cyclase and phosphodiesterase, there are wide between‐sample variations within species, both in basal levels and in levels attained after activation of the cyclase (e.g. after sperm treatment with bicarbonate). Moreover, minor changes in bulk cyclic AMP levels can result in large changes in cyclic AMP‐dependent functions. Finally, while cyclic AMP levels respond very rapidly to sperm treatment by effectors such as bicarbonate and Ca²⁺ (key components of capacitating media), there are big discrepancies between the rates of functional response. For example, enhancement of motility and collapse of phospholipid asymmetry take place within a few minutes, whereas more than 1 h of exposure to capacitating conditions is needed for cyclic AMP‐dependent protein tyrosine phosphorylation to become detectable or for the sperm population to attain a capacitated state.     

哺乳类动物精子的获能和顶体反应

介绍了在生殖过程中的2个重要的生理变化--获能和顶体反应,并综述了最近几年来在生殖生物学领域关于获能与顶体反应机制方面的最新成果.结果显示,cAMP、Ca2+、咖啡因等因素对精子获能有促进作用,ZP3、Ca2+、cAMP、肝素等因素对顶体反应有促进作用.所有研究成果表明,精子的荻能和顶体反应与精子膜的生理变化有着密切关系.     

哺乳动物精子获能机理及体外研究

精子获能是哺乳动物精卵融合之前必须经历的一个阶段。自发现精子获能现象以来,对精子获能机制的研究已取得一些进展,但仍有不少问题需要进一步研究。精子获能为体外受精研究获得突破性进展,为人类直接观察受精过程和研究受精机理奠定了基础。文章主要对精子获能的变化、机制及体外研究进行了综述。     

Signalling Compartmentalization Involved in the Boar Sperm Acrosome Reaction

Veterinary Research Communications -     

BSA在精子获能中的作用及其替代物研究进展

摘　要:精子获能(Capacitation)是受精过程能否完成的一个关键因素,是生殖机理研究和体外受精(IVF)技术研究中的一个重要方面,但精子获能的机理仍然不甚明确。精子获能孵育液和促获能物质的研究是研究精子获能的基础,牛血清白蛋白(BSA)是经典的精子获能液中不可或缺的添加物,具有促使大多数哺乳动物精子获能、防止精子质膜之间发生黏连等作用。但由于BSA 是生物制剂,化学成分不确定并且作用复杂,给试验研究带来不便。因此,成分和功能相对确定的替代物被研究,像聚乙烯醇(PVA),环化糊精(Cyclodextrin)和合成蛋白等。这方面的研究仍处于起步阶段,有必要继续进行。     

钙离子载体及咖啡因对绵羊精子获能的影响

通过添加不同浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10μmol/L)的钙离子载体(A23187,IA)及2 mmol/L咖啡因,探讨不同作用时间其对绵羊精子体外获能的影响。结果发现,IA浓度越高,精子的体外获能率越高,顶体反应率越低,活力越低,死精子就越多;而延长作用时间对获能、顶体反应的影响不明显。IA和咖啡因共同作用后,咖啡因能够促进IA诱导顶体反应的发生。建议用IA诱导绵羊精子获能时,其浓度以0.05~0.2μmol/L为宜,作用时间1 min。     

猪精子获能前后细胞亚组分蛋白分离及酪氨酸磷酸化蛋白的鉴定

本研究对猪精子获能前后细胞亚组分蛋白进行分离以及对酪氨酸磷酸化蛋白进行鉴定,旨在为哺乳动物精子受精生物学研究奠定理论基础。利用动物精子体外获能培养、细胞亚组分分离技术及蛋白免疫印迹的方法,分离猪精子细胞亚组分蛋白及酪氨酸磷酸化蛋白鉴定。结果表明,猪精子经过获能培养后各项活力指标均得到显著提高,且与精子蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰密切相关;获能精子中126、108、79ku的高分子量蛋白磷酸化程度明显高于未获能精子;分子质量约为25、47、50ku的膜蛋白及47ku胞浆蛋白发生酪氨酸磷酸化,其中25、47ku的膜蛋白酪氨酸磷酸化程度显著高于未获能精子(P<0.05);分子量约为23、37、42～50ku的核蛋白发生酪氨酸磷酸化,获能精子中23ku的核蛋白酪氨酸磷酸化程度显著高于未获能精子(P<0.05)。结果提示,猪精子细胞不同亚组分中,发生酪氨酸磷酸化修饰的蛋白以膜蛋白及核蛋白为主,同时有少量的胞浆蛋白。     

CTC法结合体外受精比较不同方法对绵羊精子体外获能的影响

为比较不同获能方法对绵羊精子的获能效果，新鲜绵羊精液分别经肝素上游法(swim-up)、钙离子载体(IA，A23187)诱导法、Percoll离心法和Percoll离心后肝素孵育法进行精子获能的诱导后与体外成熟的绵羊卵母细胞进行体外受精，并利用金霉素荧光染色（chlortetracycline，CTC）法结合各自相应的体外受精结果对其获能效果进行检验。结果显示上游法处理后精子的获能比例和受精后的卵裂率均高于其它组, 说明肝素上游法可以较好的诱导绵羊精子获能。     

哺乳动物精子质量检测原理及方法

人工授精和体外受精技术的不断发展，以及这些技术在生产实践中如各种濒危野生动物的拯救、哺乳动物繁育、人类不孕症的解决中的应用,使得精子质量评价方法也在不断改善。作者综述了精子的质膜完整性、顶体的状态、染色质状态、线粒体活性、精子DNA损伤检测以及受精能力等指标的检测原理及方法，以便准确预测精子的受精能力。     

常用哺乳动物精子质量检测方法

根据精子的特性 ,利用光学显微镜、荧光显微镜、流式细胞记数仪等仪器 ,结合常规染色技术或荧光探针技术 ,通过检测精子染色质的状态、运动能力、质膜的完整性、顶体的状态、线粒体的活性、获能、顶体反应以及与卵子的结合能力等指标来评价精子的功能状态 ,以便准确预测精子的受精能力。     

Mitochondria in Mammalian Sperm Physiology and Pathology: A Review

While, for a long time, the role of mitochondria in sperm physiology and pathology has been largely ignored, recent research points out the mitochondria as a major organelle with key roles in sperm function both under physiological and biotechnological conditions. This paper briefly reviews these novel findings regarding the role of mitochondria in sperm, paying special attention to the most practical, readily applicable, aspects of the topic such as their role as a major source of the sublethal damage that sperm experiments after cryopreservation.     

获能处理对猪精子质量及泛素对顶体酶抑制剂水平调控的影响

【目的】探究猪精子体外获能前后顶体酶抑制剂(AI)表达量以及AI的泛素化水平的变化,了解AI与泛素-蛋白酶体系统(UPS)间的联系,为深入研究泛素-蛋白酶体途径(UPP)在猪精子获能过程中的作用提供参考。【方法】选择18～24月龄的成年健康长白公猪,使用手握法采集公猪精液,将一部分精子进行获能处理,一部分作为对照(鲜精),使用计算机辅助精子分析系统(CASA)、低渗肿胀法(HOST)、考马斯亮蓝染色、Western blotting和锌离子(Zn²⁺)标记检测获能前后精子的动力学参数、质量参数、酪氨酸磷酸化水平和Zn²⁺含量;Western blotting检测获能前后精子中AI和泛素(Ub)的表达量;免疫荧光法检测AI和Ub在精子中的定位;免疫共沉淀分析AI和Ub的结合情况。【结果】与新鲜精子相比,获能精子动力学参数VSL和BCF极显著升高(P<0.01),获能精子的活力、质膜完整性、顶体膜完整性、活率均极显著降低(P<0.01);获能精子蛋白酪氨酸磷酸化水平极显著升高(P<0.01),Zn²⁺极显著...     

哺乳动物精子冷冻工艺中防冻剂的研究进展

精子冷冻是一种简单、经济、高效的生物遗传资源保存方法,目前已经应用到许多领域,并成为治疗人类不育、牲畜繁殖和生物资源多样性保护的重要手段。在精子冷冻保存过程中的适当阶段加入防冻剂,能够有效的避免或减少精子的冷冻损伤和寒害,从而提高冷冻—解冻精子的活力。作者就防冻剂的种类、防冻剂的选择及加入与去除的方式对冷冻—解冻哺乳动物精子活力的影响作一简要综述。     

牛体外受精的精子获能方法对受精率和胚胎发育的影响

从屠宰场获得牛卵巢,采取卵母细胞,成熟培养用ＴＣＭ１９９＋犊牛血清;精子获能处理,以ＢＯ液＋肝素钠为基础,三个试验组分别添加咖啡因、蔡碱和已酮可可碱,受精经分别为８１．３％、８３．３％、８８．９％,均显著高于对照组（Ｐ〈０．０１）,三个试验组的囊胚率分别为２０．４％、１９．３％、２１．２％。试验得出以下结论：囊胚率与受经成正比,添加已酮可要碱效果最好。另外组内种公牛成绩也有差异。