宇佐美曲霉木聚糖酶(xynⅡ)基因在大肠杆菌中的表达

根据宇佐美曲霉(Aspergill ususamii)E001菌株木聚糖酶xynⅡcDNA序列(GenBank登录号为DQ114485),合成1对引物(含EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点),以重组质粒pUCm-T-xynⅡ为模板,扩增得到编码xynⅡ成熟肽的cDNA片段(555bp)。将其与表达质粒pET-28a连接,构建重组表达质粒pET-28a-xynⅡ,并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,获得重组工程菌BL21xynⅡ。经IPTG诱导表达,木聚糖酶的比酶活力最高可达35.6Umg。最后采用金属Ni2 螯和层析柱对所表达的木聚糖酶进行纯化,获得电泳纯的木聚糖酶。重组表达的木聚糖酶最适温度为45℃,最适pH4.6。     

草酸青霉外切葡聚糖酶基因(cbh1)克隆及其在毕赤酵母中的表达和重组外切葡聚糖酶特性分析

木霉的纤维素酶系中通常缺少β-葡萄糖苷酶,导致了终产物抑制,木霉生长速度明显没有青霉快,因此,来源于青霉的纤维素酶受到了越来越多的重视.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从草酸青霉(Penicillium oxalicum)M菌株中克隆得到外切葡聚糖酶基因cbh1(GenBank登录号:HQ843504).该基因全长为1 641 bp,无内含子序列,编码547个氨基酸,具有Glu236,Asp238和Glu241典型催化残基,推测属于糖基水解酶第7家族.将cbh1克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达质粒pPIC9-cbh1,电击转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115菌株.阳性重组子经测序及活性分析表明,cbh1基因成功分泌表达,表明来源于草酸青霉的外切葡聚糖酶基因首次在毕赤酵母中获得成功表达.重组酶活性分析表明,其活性可达56IU/mg,最适反应pH、温度分别为6.0和55℃,且pH和温度稳定性均较好.研究结果认为,cbh1基因的克隆丰富了纤维素酶的基因资源,其在毕赤酵母中的成功表达也为该类纤维素酶基因高效工程菌株的构建提供了基础.     

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构.根据GenBank中aer毒素的基因序列（M16495）,设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pMD18-T载体克隆.酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M16495的同源性达92%,将测得的序列登录GenBank数据库,所得的序列编号为AY136943.分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示：其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%.证明aer毒素基因的5＇端保守,3＇端变异较大.     

乙烯合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)ICMP2189中克隆到了乙烯形成酶基因efe,并且在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中利用T7强启动子进行了高效表达,表达蛋白占总蛋白的45%。气相色谱分析表明,含有efe基因的大肠杆菌可以高效地产生乙烯。     

嗜水气单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及酶学分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）基因组DNA为模板,通过PCR方法首次克隆了该菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因（glyA）。将该基因插入到表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,获得含有重组质粒pGEX-glyA的重组菌株。核苷酸序列测定表明该基因（GenBank登录号：FJ797607）全长1254bp,编码417个氨基酸。重组菌株IPTG诱导表达后,经过GST-tag亲和层析纯化,得到约45kD的目的蛋白。对纯化的丝氨酸羟甲基转移酶进行酶学性质分析表明,该酶的最适反应为pH8.0,最适反应温度为20℃,Cu^2＋和Mn^2＋对该酶有激活作用,而Zn2＋和SDS对该酶有抑制作用。由于该酶的最适反应温度是20℃,使得它在工业上具有一定的应用价值,同时有助于对低温酶机制的研究。     

番茄Metacaspase基因(LeM)的克隆及其在大肠杆菌Rosetta中的高效表达

为获得可溶性的番茄Metacaspase蛋白,后续研究Metacaspase蛋白的酶学特性以及功能,利用RT-PCR方法克隆了番茄(Lycopersicon esculentum)中Metacaspase(LeM)全长cDNA,并成功地构建了LeM基因的原核表达载体重组质粒pET28a-LeM,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS和Rosetta中进行诱导表达,并对诱导表达条件进行了优化.SDS-PAGE结果显示,在37℃条件下,1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,在BL21(DE3)PlysS菌株中重组蛋白主要以包涵体形式存在,而相同条件下在Rosetta菌株中多为可溶性表达.同时酶活测定显示,Rosetta上清中LeM的活性为33 RFU/min,显著高于BL21(DE3)PlysS 7RFU/min.本实验表明,不同菌株对Metacaspase的可溶性表达有很大影响.     

鸡MxA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护效果

乳酸球菌(Lactococcus lactis)是一种安全级微生物,为活载体疫苗传递抗原的理想选择.嗜水气单胞菌(A eromonas hydrophila,Ah)能引起鱼类等多种动物的败血病,因其血清型众多,寻找共同保护性抗原是进行疫苗研究的重点.为探究嗜水气单胞菌AS1.927株外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达和检测其表达产物对小鼠的免疫保护效果,本研究将己克隆的ompA基因经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后连接载体pNZ8048,转化乳酸乳球菌NZ9000,nisin诱导表达,并进行SDS-PAGE分析鉴定.结果显示,重组基因工程菌L.lactis[pNZ-ompA]表达的融合蛋白分子量约为36.2 kD,成熟蛋白分子量约为33.7 kD.将重组基因工程菌L.lac tis [pNZ-ompA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),用放射免疫法检测末次免疫一周后的各组小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的水平以及用间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG,结果发现,该重组基因工程菌能显著提高sIgA的分泌(P＜0.05);同时在小鼠血清中的特异性抗体含量也显著高于对照组(P＜0.05).末次免疫两周后用100 LD50的Ah AS 1.927(3.3×105 cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为87.5％,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.该结果将为开发安全有效的口服基因工程鱼用疫苗提供一定的实验基础.     

pfl-act基因在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

丙酮酸甲酸裂解酶是肠道细菌在厌氧代谢中十分关键的酶,丙酮酸甲酸裂解酶激活因子(pyruvateform ate lyase activator,PFL-A)在功能上具有重要的作用。为进一步研究PFL-A的激活机理,以大肠杆菌K-12的基因组为模板,通过G enB ank上公布的序列设计引物,扩增出目的基因,克隆到pM D 18-T载体,经测序,所扩增出的基因与p f l-act基因具有99%的同源性。将p f l-act连接到高效表达载体pET-22b( )中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,结果发现,p f l-act以包涵体形式表达。改变诱导剂、诱导剂量或培养温度,对包涵体的形成均没有明显的影响。     

利用高效转座质粒克隆Streptinomonas maltophilia YHJ-1的分解羽毛相关基因

嗜麦芽窄食假单胞菌Streptinomonas maltophilia YHJ-1是一株能高效降解羽毛角蛋白的菌株;该菌对卡那霉素等多种抗生素不敏感。本实验利用携带Tn5转座酶和卡那霉素抗性转座质粒pRL27和含氯霉素抗性基因盒的pMCm质粒,构建了以氯霉素抗性作为选择标记的转座质粒pRH30。以E. coli UQ3021/pRH30为供体,通过双亲本杂交,构建了S. maltophilia YHJ-1的插入突变体文库,该库共含1246个转化子。随机挑选4个突变子的氯霉素抗性检测和PCR扩增测序分析结果显示文库是可靠的。已从文库中筛选出3株不能降解羽毛转化子,表明利用氯霉素抗性的转座质粒pRH30来构建菌株YHJ-1的突变体是克隆其相关基因并进行遗传分析的有效方法。     

犬白细胞介素-2 基因(IL-2 )的克隆与表达

根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)IL-2基因序列，设计了1对引物。采用RT-PCR技术，以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料，从总RNA中扩增出犬IL-2基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为550bp。分离纯化片段，克隆入pMD18-T载体，经酶切鉴定，测序结果显示，克隆的犬IL-2基因与GenBank上发表的序列一致，生物软件分析结果表明该序列与牛、羊和鹿的亲源性更近。构建表达质粒pET28-CaIL-2，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21，IPTG诱导表达，SDS—PAGE电泳显示21．8kD左右的表达条带。MTT比色法测定活性结果表明：表达的重组犬IL-2蛋白具有极显著的体外增殖活化淋巴细胞的活性。     

玫瑰黄链霉菌几丁质酶基因的克隆及拼接表达

应用PCR扩增克隆到玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)的几丁质酶基因chiC的整个催化域部分,将其与包含信号肽区、纤维素结合区、几丁质结合区三个结构功能域的链霉菌(S.lividans)chiC基因片段相连接,插入pET23b( )质粒上,构建表达载体pLCH,用来转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(DE3),转化子进行破壁之后在胶体几丁质酶培养基上表现活性。     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。     

河南良杂猪白细胞介素18基因的克隆及其成熟蛋白在大肠杆菌中的表达

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)又称为干扰素γ诱生因子(interferon gamma inducing factor,IGIF).Okamura and Tsutsui(1995)首次从中毒性休克的鼠肝脏中克隆出了该因子.Muneta et al.(1999,2000)从猪肺泡巨嗜细胞中克隆到pIL-18,并证明表达pIL-18的成熟蛋白比前体蛋白具有更高的活性.本研究选择河南省普遍喂养的良杂猪,对其IL-18基因进行扩增及序列测定,并实现了成熟蛋白在大肠杆菌中的初步表达.     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及其在大肠杆菌中的表达

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的两条互补的寡核苷酸链,退火后在5’端和3’端分别形成BamHI和XhoI位点的粘性末端。合成的LfcinB基因定向克隆到pET-32a原核表达载体,阳性克隆菌用TB培养基进行扩大培养,然后用终浓度1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示,LfcinB基因在大肠杆菌中获得了大量表达,表达蛋白以包涵体形式存在,利用TGE透析液对纯化的LfcinB重组蛋白包涵体进行了复性,复性的LfcinB重组蛋白的纯度为96.6%。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛(Bos tarus)的增食欲素受体1(HCRTR1)基因编码区全长,获得1 278 bp编码区全长序列(GenBank登录号:DQ874350),将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%.阳性质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,将目的片段定向克隆到pET32a( )表达载体上,转化B121(DE3)感受态大肠杆菌(Escherichia coli),经鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE表明,秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达,进一步生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,复杂的蛋白质结构使得其不能在原核表达系统中获得表达.