利用CRISPR/CAS9技术构建山羊乳腺上皮细胞TPH1基因敲除细胞系

五羟色胺(5-hydroxytryphtamine,5-HT)是机体重要的单胺类神经递质,广泛分布于动物体各组织器官并参与机体多种生理功能。色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)1是5-HT合成的限速酶,在5-HT调控机体代谢过程中起关键作用。本研究旨在利用CRISPR/CAS9技术建立稳定敲除TPH1基因的山羊(Capra hircus)乳腺上皮细胞系,为研究山羊乳腺中5-HT调控山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cells,GMEC)钙离子代谢的分子机理提供实验材料。首先根据Gen Bank中山羊TPH1基因序列(Gen Bank No.:102184739),设计靶向TPH1基因第一外显子的单导链RNA(single guide RNA,sgRNA),用pX458和pX459分别构建重组真核表达载体pX458-sgRNA和pX459-sgRNA,将重组质粒转染山羊乳腺上皮细胞,使用嘌呤霉素(1μg/mL)进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养,用Western blot、T7E1酶切、基因组DNA测序等方法鉴定基因敲除效果。结果显示:通过CRISPR/CAS9技术成功在TPH1基因第一外显子打靶产生10 bp碱基缺失。本研究成功构建并筛选获得了TPH1基因稳定敲除的单克隆山羊乳腺上皮细胞系,为5-HT调控乳腺生理的功能研究提供了重要材料。     

奶山羊超长链脂肪酸延伸酶6基因(ELOVL6)的克隆及其对4个脂肪酸代谢基因表达水平的影响

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)是长链脂肪酸延长反应的限速酶。本研究旨在通过对奶山羊(Capra hircus)ELOVL6基因的克隆、组织表达分析以及腺病毒(Adenovirus)介导的超表达技术,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响。利用RT-PCR技术克隆了奶山羊ELOVL6基因的CDS区;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因在泌乳期奶山羊10个组织中的相对表达量;构建该基因的重组腺病毒超表达载体,包装出高滴度的腺病毒并感染奶山羊原代乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测ELOVL6超表达效果及其对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明,ELOVL6基因CDS区序列长度为795 bp(GenBank登录号:KF667508),共编码264个氨基酸。同源分析发现,奶山羊ELOVL6基因CDS区核酸序列与牛(Bos taurus)、大鼠(Rattus norvegicus)和人(Homo sapiens)的同源性分别为97%、90%和93%,氨基酸序列同源性分别为99%、92%、95%。利用TMpred对ELOVL6蛋白跨膜结构预测分析,发现该蛋白有5个跨膜区,保守的组氨酸模体(HXXHH)位于ELOVL6蛋白的第二与第三跨膜螺旋间。ELOVL6蛋白质疏水性预测显示,该蛋白总体具有较强的疏水性。组织表达分析显示,ELOVL6基因在脂肪组织中表达量最高(P0.01),小肠次之(P0.01),心脏中表达量最低。超表达ELOVL6基因的重组腺病毒的滴度为108U/mL,病毒液感染原代乳腺上皮细胞48 h后,ELOVL6基因的表达量上升约200倍;脂肪酸代谢相关基因检测分析发现,固醇调节元件结合蛋白-1基因(SREBP-1)的表达量显著下降(P0.05),脂肪分化相关蛋白基因(ADRP)的表达量显著升高(P0.05),过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARγ)及脂肪酸转位酶基因(CD36)的表达量无明显变化。研究结果表明,ELOVL6基因可以影响奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢相关基因的表达,对乳腺脂肪酸代谢具有一定的调控作用。本研究为ELOVL6基因在奶山羊乳腺脂肪酸代谢调控中的功能研究提供研究依据。     

无抗性标记的人白血病抑制因子打靶载体的构建及表达

为了实现人白血病抑制因子基因(hLIF)在奶山羊乳腺上皮细胞中的稳定表达,本实验利用条件重组元件LoxP序列、山羊β-酪蛋白5'和3'同源臂、正负向筛选标记基因和hLIF基因构建hLIF基因打靶载体。脂质体法转染奶山羊(capra hircus)乳腺上皮细胞,进行遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)筛选获得同源重组的阳性克隆,并通过PCR、实时定量PCR和Western blot检测阳性克隆中hLIF基因的表达情况。酶切和测序分析结果显示,实验成功构建了hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。阳性克隆经PCR、实时定量PCR和Western blot均检测到了目的条带。表明打靶载体pLoxP-NT53L已经成功整合至山羊β-酪蛋白基因座中,并能在奶山羊乳腺上皮细胞中特异性表达hLIF蛋白。为无抗性标记的转hLIF基因奶山羊生产提供了打靶载体。     

表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中,得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔ E1,3Cre共转染293细胞,包装出重组腺病毒Adv-gC。通过PCR鉴定和病毒空斑纯化,得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌注免疫Balb/c小鼠,能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。攻毒试验表明,此重组病毒能提供100%的免疫保护。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S蛋白基因5'端包含 B、C抗原位点的1.0 kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5'端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay, IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为107. 7TCID50/mL。动物免疫试验显示, rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。     

西农萨能奶山羊脂联素受体1基因(AdipoR1)cDNA克隆、表达及功能分析

脂联素(adiponectin)具有改善胰岛素敏感性,调节脂肪酸代谢和参与细胞增殖和分化的功能。本研究参考Gen Bank中已收录的牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等物种脂联素受体1基因(adiponectin receptor 1,Adipo R1)序列的同源比对结果,设计和合成PCR扩增引物,采用反转录PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Adipo R1的c DNA序列。结果显示,Adipo R1全长2 032 bp(Gen Bank登录号:HQ846828),包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1 128 bp,3’非翻译区(untranslated regions,UTR)719 bp和5’UTR 185 bp,该基因编码375个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,山羊与牛、猪(Sus scrofa)、小鼠和人的Adipo R1相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质的分子量为42.44 k D,等电点为7.19,含7个跨膜结构域,并且整个序列中不含信号肽。组织表达分析显示,该基因在肺中的表达量最高,小肠次之,在心脏中表达量最低,而其余8个组织中Adipo R1m RNA水平变化则比较平缓;奶山羊乳腺组织中Adipo R1表达量分析表明,Adipo R1的表达量在干奶期和泌乳盛期乳腺组织差异显著(P<0.05)。用不同浓度胰岛素(insulin)和催乳素(prolactin)处理奶山羊乳腺上皮细胞,结果发现,用胰岛素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量下调,在胰岛素浓度为50 nmo/L时效果最明显(P<0.01);用催乳素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量上升,在浓度为100 mg/m L时作用最明显(P<0.05),表明该基因在奶山羊乳腺上皮细胞中具有一定的调控作用。本研究为进一步揭示Adipo R1基因在奶山羊乳腺组织中的功能提供基础资料。     

鸡MxA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。     

α-半乳糖苷酶基因Mell在毕赤酵母中的组成型表达

用PCR方法从酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH109中扩增出α-半乳糖苷酶的Mell基因,将其克隆至整合型载体pGAPZαA中构建成组成型分泌表达酶产物的重组质粒pGAPZα-Mell.将线性化的重组质粒pGAPZα-Mell电击转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71,在含有100 mg/mL zeocin和预先涂布有X-α-gal的YPDS平板上选择蓝色阳性菌落.发酵培养酵母的上清经SDS-PAGE分析,在53 kD处有特异带;经非变性PAGE凝胶电泳,与显色底物的反应,检测到α-半乳糖苷酶活性带.重组菌pGAPZα-Mell/KM71摇瓶发酵6 d后,培养液α-半乳糖苷酶粗酶活性为12 U/mL.     

整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞系的建立

通过转基因动物乳腺表达系统生产重组药用蛋白比微生物发酵系统和动物细胞培养系统具有很多优势;同时,体细胞核移植技术为制备动物乳腺生物反应器开辟了一条新的途径。本实验旨在建立稳定整合人乳铁蛋白cDNA的山羊胎儿成纤维细胞系,为体细胞核移植法制备转基因动物提供可靠的供体细胞。本研究采用RT-PCR获得人乳铁蛋白cDNA,通过Long and Acute PCR扩增山羊β-酪蛋白5’ 端6.5 kb的调控序列,以pEGFP-C1为骨架构建乳腺特异性表达载体 p6.5hLF-EGFP。脂质体介导法转染山羊胎儿成纤维细胞,G418抗性筛选3-4周后,经PCR扩增和报告基因EGFP表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞系,为制备高效表达人乳铁蛋白的转基因山羊乳腺生物反应器提高可靠的核移植供体细胞。     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

荷斯坦奶牛杀菌/通透性增加蛋白N端cDNA在大肠杆菌中的融合表达

参照GenBank中安哥斯牛杀菌/通透性增加蛋白(BPI)序列,设计合成1对引物.应用RT-PCR技术,从荷斯坦奶牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白N端,将该序列与原核表达载体pGEx-4T-1连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BPI.重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),用IPTG诱导表达.结果表明,获得了BPIN端长度为714bp的cDNA序列,序列分析证实在第503位出现了点突变.重组质粒诱导表达后,经SDS-PAGE电泳检测重组蛋白约在52 kD处出现特异性蛋白条带.     

猪细小病毒VLPs供外源蛋白插入的候选位点发现及其重组PCV2-ORF2的病毒样颗粒构建

先将猪细小病毒(PPV)SC-1株VP2基因扩增产物克隆到pMD18-T载体构建质粒pMD-VP2;设计两对引物(分别引入Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个酶切位点)扩增猪圆环病毒二型(PCV2)SC株ORF2基因,构建了pMD-ORF2.A和pMD-ORF2.B两质粒;经相应内切酶酶切后回收目的片段,插入PPV SC-1株VP2基因的Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个特异限制酶切位点处(分别对应于PPV VP2蛋白N端和C端1/3处),得到重组质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B.经鉴定后的质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和ApaL Ⅰ三酶切,回收含VP2和ORF2基因的目的片段克隆至真核表达载体(pEGFP-C1),得到重组质粒pEGFP.VO.A和pEGFP.VO.B.脂质体法转染重组质粒于Cos7细胞后,采用荧光显微镜和电镜观察基因表达情况,结果仅在转染pEGFP.VO.A的样品中观察到了病毒样颗粒(VLPs).纯化VLPs免疫小鼠,结果显不能产生较好的细胞免疫和针对PPV和PCV2的特异性体液免疫,该结果表明研究中获得了PCV VP1-PCV2ORF2重组VLPs,同时也揭示PPV VPLs的N端1/3适于外源蛋白插入构建重组VLPs     

弹性蛋白酶基因(PAE)的克隆及在毕赤酵母中的表达

以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(P.acruginosa elastase,PAE)基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%.成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE,莺组质粒Sac Ⅰ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71中,通过PCR和表型鉴定表明,PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上.经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子.在甲醇诱导下,经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带,大小为34kD.活性检测结果,酶活为1 060 U/mL,是出发菌株的26倍.     

α-半乳糖苷酶基因Mel1在毕赤酵母中的组成型表达

用PCR方法从酵母(Saccharomycescerevisiae)AH109中扩增出α-半乳糖苷酶的Mel1基因,将其克隆至整合型载体pGAPZαA中构建成组成型分泌表达酶产物的重组质粒pGAPZα-Mel1。将线性化的重组质粒pGAPZα-Mel1电击转化至毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71,在含有100mg/mLzeocin和预先涂布有X-α-gal的YPDS平板上选择蓝色阳性菌落。发酵培养酵母的上清经SDS-PAGE分析,在53kD处有特异带;经非变性PAGE凝胶电泳,与显色底物的反应,检测到α-半乳糖苷酶活性带。重组菌pGAPZα-Mel1/KM71摇瓶发酵6d后,培养液α-半乳糖苷酶粗酶活性为12U/mL。     

流感病毒血凝素茎干部通用疫苗的构建及免疫原性研究

为了构建基于血凝素(hemagglutinin,HA)茎干部的流感通用疫苗并研究其免疫原性,本研究以A/Puerto Rico/8/1934(H 1Nl)流感病毒为模板,扩增HA茎干部区域主要蛋白HA2(HA的344～566 aa)和完整茎干部HA-stem(缺失53 aa～276 aa的HA),与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒.将重组质粒瞬时转染至HEK-293T细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光实验检测其表达情况.将6～8周龄健康雌性BALB/c小鼠(Mus musculus)分为4组,即2个重组质粒组及pCAGGS质粒对照组和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)对照组,分别于0和30 d免疫2次,在免疫当天(第0天)及免疫后第60天采集小鼠眼眶血,测定其HI抗体、细胞中和抗体和IFN-γ水平.结果表明,成功构建了重组质粒pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem,且重组质粒转染HEK-293T细胞后均能检测到目的蛋白及其mRNA.免疫后第60天pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem免疫组对A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)病毒的HI抗体效价均为5 log2,中和抗体效价分别为1∶27和1∶24.对异源病毒A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)病毒的HI抗体效价分别为3 log2和6 log2,中和抗体效价分别为1∶24和1∶22.pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem组1NF-γ含量分别为(2362.40+98.24) ng/L和(2497.06+ 120.44) ng/L.pCAGGS-HA2及pCAGGS-HA-stem诱导产生的抗体及INF-γ水平与免疫前及对照组相比差异显著(P＜0.05).结果表明,pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem能够诱导对异源病毒的交叉反应,有望作为候选的流感通用疫苗.     

大肠杆菌yqhD基因的克隆与表达

以大肠杆菌E scherich ia coli K-12基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到假定的氧化还原酶(pu tative ox idoreductase)基因yqhD,将它连接到克隆质粒pGEM-3zf(+)上,得到重组质粒pGEM-yqhD,对此重组质粒进行序列测定,对其DNA序列分析表明,yqhD基因全长为1 164 bp。再将yqhD基因插入表达载体pSE 380,构建成重组子pSE 380-yqhD,并在E.coli BL 21中获得表达。研究表明,以1,3-丙二醇为底物时,基因工程菌在30°C下,以1.0 mm o l/L IPTG诱导12 h的酶活力达到3.13 U/mL,比对照菌株提高4.4倍。     

CD14沉默的猪小肠上皮细胞系的建立及其对大肠杆菌黏附能力的变化分析

白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen 14,CD14)在先天性免疫和适应性免疫反应中都发挥重要调控作用,本研究旨在构建猪(Sus scrofa)CD14基因的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)干扰载体,包装成慢病毒,转染猪小肠上皮细胞,在细胞水平上进行相关功能探讨.本研究参照CD14基因(GenBank登录号:EF626695.1)全长编码区序列,设计4个靶向猪CD14基因的shRNA干扰序列,将其克隆至慢病毒表达载体质粒中,分别命名为pGLV3-CD14-1、pGLV3-CD14-2、pGLV3-CD14-3和pGLV3-CD14-4,以及阴性对照pGLV3-CD14-NC.包装成功后转染猪小肠上皮细胞系IPEC-J2,利用qRT-PCR检测其干扰效率.选择干扰效率最高的慢病毒进行药筛,获得CD14基因稳定沉默的猪小肠上皮细胞系.大肠杆菌(Escherichia coli)黏附实验检测大肠杆菌F18ab和F18ac对CD14基因沉默小肠上皮细胞黏附能力的变化.结果表明,本研究成功构建4个shRNA表达载体,包装成的慢病毒均能降低猪CD14mRNA表达水平,其中pGLV3-CD14-3慢病毒的干扰效果最好,其干扰效率达到94.6％;CD14基因沉默后F18ab对小肠上皮细胞的黏附能力显著增强,而F18ac虽然也有上调,但并未产生显著性差异.研究结果表明,CD14基因沉默后的小肠上皮细胞对大肠杆菌F18ab的黏附能力显著增强,CD14基因可能在小肠上皮细胞抵御大肠杆菌F18ab感染过程中发挥了重要的调控作用.慢病毒介导的CD14沉默的猪小肠上皮细胞系的建立,不仅为在细胞水平研究CD14基因功能提供了有效模型,也为进一步探究其所在的Toll样受体/白介素-1受体(toll-like receptors/interleukin-1 receptor,TLRs/IL-1 R)信号通路在猪肠道病原微生物引起的免疫反应和抵御病原入侵的调控机制奠定了基础.     

牛乳腺细胞系BME-L1β-酪蛋白分泌的诱导及人促红细胞生成素(hEPO)的表达

用悬浮胶元(floating gel)及生乳激素(lact ogenic hormones)诱导BME-L1细胞合成并分泌了β-酪蛋白,证明了BME-L1所具有的上皮性质.用质脂体介导法向BME-L1转入含人促红细胞生成素(hEPO)基因的质粒pBCE,经生乳激素及悬浮胶元诱导,这些细胞短暂表达hEPO.讨论了影响乳腺细胞内源乳蛋白基因及外源基因表达效率的因素.     

猪干扰素γcDNA的分子克隆与在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR技术从猪脾淋巴细胞总RNA中扩增出猪干扰素γcDNA(SwIFN-γ2).SwIFN-γ2与已报道的猪干扰素γ序列基本一致,仅在462位核苷酸处发生了点变异.在SwIFN-γ2成熟蛋白基因两端分别合成含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到pQE30表达载体,转化宿主菌SG13009(pREP4),经IPTG诱导表达了N'端含6个组氨酸的重组猪干扰素γ(6His-rSwIFNγ2).重组干扰素的表达量占总菌体蛋白的33.5%.采用Ni-NTA金属螯合亲和层析纯化6His-rSwIFNγ2,其纯度达90%以上,经8 mol/L尿素溶液变性、透析复性后,其抗滤泡性口炎病毒比活性为8×103～1.6×104U/mg.     

Dvl1及其突变体腺病毒载体的构建与在MSCs中表达鉴定

Dvl1及其结构缺失突变体ΔDIX（dsh and axin）和ΔDEP（dsh,Egl-10 and pleckstrin）腺病毒载体的构建并验证其在MSCs（mesenchymal stem cells）中的表达情况。将目的基因定向克隆至pAdTrack-CMV穿梭载体上,并经PmeⅠ线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组,获得重组腺病毒载体,在QBI-293A细胞中包装及扩增,实时荧光定量PCR和Western bolt验证Dvl1在MSCs中的表达情况。经PCR、PacⅠ单酶切鉴定及测序分析,成功构建Ad-Dvl1、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP腺病毒载体,目的基因序列与GenBank报道一致,并选出150 MOI为最适感染MSCs的感染复数,成功构建了Ad-Dvl1、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP腺病毒载体,并获得高滴度的病毒子,qPCR和Western blot证实Dvl1在MSCs中高表达并增加了β-catenin在细胞中的累积,为进一步研究Dvl1在MSCs迁移过程的作用奠定了基础。