发酵法生产鸡粪饲料的菌种选择研究

试验分别用乳酸菌发酵粉、酵母菌发酵粉、枯草芽孢杆菌发酵粉和混合菌种发酵发酵鸡粪,制作鸡粪饲料.结果表明,与直接发酵相比,有益微生物发酵不但可改善鸡粪的感观性能,增加其适口性;而且能抑制鸡粪大肠杆菌的生长,杀灭鸡粪中沙门氏菌;同时还能显著提高鸡粪饲料的真蛋白质含量,降低粗纤维含量.其中以混合菌种发酵粉发酵效果最好,发酵后大肠杆菌降低了4个数量级,沙门氏菌全被杀灭;真蛋白质含量高达15.12％,是发酵前的1.71倍,而粗纤维下降至6.21％,比发酵前下降了4.95个百分点.将混合菌种发酵的鸡粪添加到育肥猪饲料中,饲喂20 d,能显著提高猪的日增重,降低饲料费用投入,增加产出,与对照组相比,试验组利润增加24.6元/头.     

鸡粪中沙门氏菌和大肠杆菌O78多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌O78的方法,本研究根据沙门氏菌inv A基因和大肠杆菌O78 O-抗原特异基因序列设计引物,并在细菌16S r DNA区设计内参引物,通过各项参数调整优化,建立了能够直接从样品中同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O78的多重PCR检测方法。结果显示:该方法可以同时扩增出O781 113 bp和沙门氏菌821 bp的特异片段以及细菌16S r DNA 527 bp的通用片段,而对于其他13种肠道致病菌只能扩增出527 bp的细菌同源片段,具有较强的特异性。该体系检测沙门氏菌和大肠杆菌O78的最低检出限分别为10~3cfu/m L和10~2 cfu/m L。增菌5 h,鸡粪模拟污染菌样品中沙门氏菌和大肠杆菌O78的检测灵敏度分别为10~3 cfu/m L和10~2 cfu/m L。本研究建立的检测方法能够在8 h内完成鸡粪样品中两种靶标菌的快速检测,对于沙门氏菌和大肠杆菌O78的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。     

肠出血性大肠杆菌O157多重PCR检测方法的建立

为了建立肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157的多重PCR检测方法,本研究选取调控基因fusR与n5512,联合经典的rfbE、stx1和stx2基因,共同作为靶基因,通过对引物浓度等参数优化,建立了稳定性好的检测EHEC O157的多重PCR方法。并检测了该方法的特异性与敏感性,结果显示,该方法对非O157的产志贺毒素的大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、沙门氏菌、假结核耶尔森菌等检测均为阴性,特异性强;对EHEC基因组DNA的检测下限约为2.27×10~(-2)ng/μL,对EHEC CFU的检测下限约为104cfu/mL。对人工感染菌的样品进行检测,增菌前与增菌后的检测限分别为:饲料,4×10~3cfu/g和4×10~(-4)cfu/g;土壤,4×103cfu/g和4×10~(-2)cfu/g;牛肉,8×10-1cfu/g和8×10-3cfu/g;废水,4×103cfu/g和4×10~(-3)cfu/g。该方法还能检出感染了EHEC O157小鼠的粪便。综上,本研究建立了一种优化的EHEC O157多重PCR检测方法,为动物养殖与肉品加工过程中EHEC O157的检测提供了便捷、灵敏、可靠的技术手段。     

复合益生菌对鸡粪饲料发酵效果的影响

为了观察鸡粪发酵前后蛋白质品质变化情况,试验采用复合益生菌发酵的方法对鸡粪进行处理并进行品质鉴定。结果表明:复合益生菌可有效改善鸡粪饲料的感观性状,增加饲料的适口性,并能有效抑制鸡粪中大肠杆菌的生长,杀灭沙门氏菌,同时还能明显提高鸡粪饲料的真蛋白质含量,降低粗纤维含量;发酵鸡粪饲料中真蛋白质含量为23.09%,较发酵前增加了27.64%,粗纤维含量为6.77%,较发酵前下降28.44%。说明在家畜日粮中添加发酵鸡粪可以代替部分蛋白质饲料使用。     

利用有益微生物发酵开发鸡粪饲料的探讨

试验采用直接发酵和接种复合有益微生物发酵的方法处理鸡粪 ,并用 2 0头大约克×荣昌猪杂交一代肉猪进行 110d饲养试验。结果表明 ,直接发酵和接种复合有益微生物发酵 ,通过 10d的处理可以消除鸡粪中的沙门氏菌 ,大肠杆菌数量分别减少 6 0 4倍 (1 39× 10 8∶2 3× 10 6)和 5 346倍 (1 39× 10 8∶2 6× 10 4) ;用接种复合有益微生物发酵鸡粪饲料与精料配合饲喂肉猪 ,试验组猪日增重高于对照组 ,但差异不显著 (P >0 0 5 ) ;饲料利用率提高5 2 % (料肉比 3 6 6∶3 86 ) ;每千克增重饲料成本降低 0 98元 (4 86∶5 84元 /kg)。     

肉牛养殖场饲料中的大肠菌群及沙门氏菌的检测与分析

[目的]为了了解新疆伊犁地区和阿克苏地区肉牛养殖场的饲料受致病菌污染程度,对所采集的18份饲料样品中的大肠菌群及沙门氏菌进行检测。[方法]沙门氏菌的检测按照中华人民共和国国家标准GB/T13091-2002(饲料中沙门氏菌的检测方法)中所规定的方法进行,大肠菌群的检测按照中华人民共和国国家标准GB/T18869-2002(饲料中大肠菌群的测定)中所规定的方法进行。[结果]麦秆饲料中大肠菌群最高,达到11000个/100g;经加工的饲料(颗粒料、棉籽粕、菜籽粕)中大肠菌群含量都较低,数量低于40个/100g;在所有饲料样品中均未检出沙门氏菌。[结论]所检测的18份肉牛饲料样品均不同程度受到大肠菌群的污染。     

散养土鸡蛋内外沙门氏菌和大肠杆菌的检测

通过对传统方法的改进,对采自皖南山区的80枚土鸡蛋样品进行了沙门氏菌和大肠杆菌的检测。结果显示,蛋黄沙门氏菌感染率为2.5%,蛋清沙门氏菌感染率为5.0%,蛋黄和蛋清均无大肠杆菌感染。蛋壳表面沙门氏菌感染率为27.5%,大肠杆菌的感染率为80%,沙门氏菌带菌数为1.22×103,大肠杆菌带菌数为3.41×104。结果表明,山区放养土鸡,需在饲养、土鸡蛋收集等环节减少沙门氏菌和大肠杆菌的污染途径,加强种鸡选留中沙门氏菌净化的同时,做好鸡蛋储藏和孵化过程中蛋壳消毒工作。     

发酵乳中沙门氏菌依赖解旋酶恒温基因扩增快速检测方法的建立

建立依赖解旋酶恒温基因扩增（helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA）快速检测发酵乳中沙门氏菌方法。以沙门氏菌invA基因序列为目的基因,设计特异性引物,优化反应体系中UvrD解旋酶及T4 gp32添加量,建立最优反应体系。通过HDA方法直接检测发酵乳中沙门氏菌,扩增其产物后进行电泳检测,验证方法特异性。结果表明：采用HDA快速检测法检测发酵乳中沙门氏菌特异性良好,优化后反应体系体积50 μL时,UvrD解旋酶添加量为0.10 μg,T4 gp32添加量为5.0 μg,得到与设计序列长度（304 bp）一致的扩增产物,检出限为2.6×102 CFU/g;该方法用于快速检测发酵乳中沙门氏菌能够满足检测需求,具有较高的灵敏度、易操作,可作为一种基础且快速的方法检测发酵乳中沙门氏菌。     

规模化猪场环境中病原菌的调查

为了解规模化猪场环境中的细菌数量与主要病原菌的分布情况。本试验在荣昌地区2个具有代表性的规模化养猪场中采集空气、排污水、粪便和土壤进行细菌总数检测,并对细菌(葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)进行分离鉴定。结果显示,2个猪场空气、排污水、粪便和土壤样本细菌总数分别为(7.95~50.7)×103 cfu/m3、(0.98~22.10)×105 cfu/mL、(989~12 600)×104 cfu/g、(6.30~37.2)×104 cfu/g;细菌经分离鉴定有79株,其中葡萄球菌30株、链球菌15株、大肠杆菌29株、沙门氏菌5株。结果表明该地区规模化猪场的土壤样本有轻、中度污染,其余样本的细菌总数都符合国家规定;分离的主要病原菌中葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌较多,沙门氏菌较少,其致病性还有待进一步检测。这为当地猪场的卫生消毒和疾病防控提供了重要的参考数据。     

鸡大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌SYBR Green Ⅰ多重定量PCR方法建立

研究旨在鉴别检测鸡场中大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌等4种常见病原菌。试验在已有4种病原菌单一定量PCR检测方法的基础上,采用SYBR GreenⅠ多重定量PCR检测方法检测大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌。结果显示,建立检测鸡大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌SYBR GreenⅠ多重定量PCR检测方法与其他菌株无交叉反应;大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌的最低检测限分别为5.6×10¹、8.9×10⁰、7.8×10⁰、3.8×10¹CFU/mL;Ct值变异系数在2.22%之内。研究表明,试验所建立的方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可应用于临床中大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌感染的快速检测。     

猪转移因子对犬中性粒细胞数量和活性的影响

按标准方法提取制备了猪的转移因子（transfer factor, TF）,用吞噬杀伤试验MTT法检测了供试杂种牧羊犬肌肉注射猪TF后外周血中性粒细胞吞噬杀伤活性的变化。试验摸索出MTT法测定犬外周血中性粒细胞吞噬杀伤大肠杆菌的最佳条件为：中性粒细胞浓度1.3×106个/ml、大肠杆菌浓度6×105个/ml 时,大肠杆菌和中性粒细胞混合培养2 h,加入MTT后继续培养4 h。体外试验结果表明,猪TF浓度在0.052～1.56 mg/ml范围内,能够明显促进中性粒细胞吞噬杀菌作用,当猪TF浓度为1.56 mg/ml时,对中性粒细胞杀菌活性的影响最大。体内试验结果表明,注射猪TF后第2 d,外周血中性粒细胞数量最高,中性粒细胞吞噬杀菌能力最强。     

柔嫩艾美耳球虫电穿孔转染条件的优化

低转染效率一直是利用基因转染技术研究柔嫩艾美耳球虫的主要屏障。为了进一步提高现有的转染效率,本研究分别利用传统的Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪和新型的NucleofectorⅠ核转仪对柔嫩艾美耳球虫子孢子的转染条件进行了优化。通过对外源DNA浓度、电场强度、环境温度及NucleofectorⅠ核转仪的内置程序这些关键参数的探索,最终发现利用Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪设置电压为2000 V,电容25 μF,利用4 mm电击杯进行电转时,转染效率最高,达到3.8×10-4,此时最佳质粒浓度为50 μg/107子孢子。     

牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒VP1基因片段的克隆与表达载体的构建

为研究鸭肝炎病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达情况,根据鸭肝炎病毒核苷酸序列设计1对外引物和1对含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的内引物。以内外引物进行PCR扩增,将所得PCR产物回收,以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET-32a后构建重组表达载体,并转入宿主菌BL21和Rosseta,经酶切、PCR和测序鉴定,证明VP1基因正确插入了表达载体。用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,结果表明,VP1基因片段在大肠杆菌Rosseta和BL21中均难以表达。     

人工感染堆型艾美耳球虫的雏鸡小肠病理学观察

本试验利用常规病理学方法,对人工感染5×104个堆型艾美耳球虫卵囊的雏鸡,在感染该球虫后7 d,即在堆型艾美耳球虫的一个生理周期内,对雏鸡的病理变化进行观察。眼观所见主要病理变化为小肠前段充血,肠壁变薄,苍白色,内容物含浆液量增多。病理组织学变化主要为小肠前段黏膜层有脱落,绒毛上皮细胞有变性、坏死、脱落,不同时期细胞内含有多量不同发育阶段的虫体。     

布拉酵母菌对肠道菌群紊乱的调整作用研究

为了探讨布拉酵母菌对肠道菌群紊乱的调整作用,作者用盐酸林可霉素给小鼠灌胃,造成肠道菌群失调,然后采用不同剂量的布拉酵母菌冻干粉进行调整,结果表明,布拉酵母菌对肠道菌群紊乱有调整作用,且中、低剂量（1~5亿/g）比高剂量（10亿/g）作用效果好。     

鸭源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

为调查鸭源致病性大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的存在情况,利用PCR对20株临床分离的耐氟苯尼考的致病性大肠杆菌进行floR分子检测,分子检测结果显示,全部菌株floR基因阳性;对其中2株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序,结果表明,鸭源大肠杆菌floR基因片段的克隆测序结果与预期所得片段结果相符,长度为753 bp,2株鸭源大肠杆菌floR基因的同源性为99.6%,与牛源、鸡源等floR基因的同源性为84.8%～99.9%。系统发育分析发现,2株鸭源大肠杆菌floR基因不在同一支上,亲缘关系较远,表明floR基因的亲缘关系与该基因的来源动物无关。     

5株堆形艾美耳球虫线粒体cox3基因的扩增及序列分析

以5株堆形艾美耳球虫为研究对象,对其线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基(cox3)的部分基因(pcox3)进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的顶复门原虫相关序列进行比较,研究其线粒体cox3基因遗传变异情况。结果每个虫株均获得572bp的目的片段,利用DNAStar软件进行序列比对,5株堆形艾美耳球虫线粒体pcox3序列完全一致,与疟原虫和住白细胞虫相应序列的相似性分别为51%和50%,而与泰勒虫的相似性少于50%。本研究首次报道了堆形艾美耳球虫pcox3序列,结果显示不同来源的堆形艾美耳球虫pcox3序列没有差异,与毒力无关,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。     

四种植物提取物对大肠杆菌的抑菌效果研究

 为充分利用当地资源和进一步开发植物药进行畜禽大肠杆菌病防治提供科学依据,采摘了本地生长的马鞭草、马齿苋、忍冬藤、蒲公英等四种植物,应用水提醇沉法制备提取液,用纸片扩散法和试管两倍稀释法对猪源、鸽源、牛源大肠杆菌进行体外抑菌效果试验,同时以小鼠为试验动物,检测四种植物提取液体内的抗菌作用。结果显示,四种植物对猪源大肠杆菌的抑菌圈在10～14 mm之间,均为中敏;对鸽源大肠杆菌在10～22 mm之间,马鞭草极敏,蒲公英高敏;对牛源大肠杆菌在7～14 mm之间,马鞭草高敏,蒲公英、忍冬藤中敏,马齿苋低敏。马鞭草对猪源、鸽源大肠杆菌的MIC和MBC是31.25 mg/mL,对牛源是62.5 mg/mL;蒲公英对猪源、鸽源的大肠杆菌MIC和MBC是62.5 mg/mL,对牛源是125 mg/mL;马齿苋对猪源的MIC和MBC是62.5 mg/mL和125 mg/mL,对鸽源、牛源的MIC和MBC分别是125 mg/mL和250 mg/mL;忍冬藤对猪源、牛源的MIC和MBC分别是125 mg/mL和250 mg/mL,对鸽源MIC和MBC是62.5 mg/mL和125 mg/mL。小鼠体内抗菌作用提示,用蒲公英和马鞭草1.88 g/kg、马齿苋和忍冬藤3.75 g/kg进行预防,可使感染大肠杆菌的小鼠成活率为达100%。四种植物提取液对大肠杆菌体外抑菌和体内抗菌均有较好的效果,马鞭草效果最好