咖啡酸对玉米赤霉烯酮诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

卵巢颗粒细胞通过与卵母细胞相互作用及其自身分泌作用为卵泡的形成和发育成熟提供特殊的微环境。多种有害刺激可引起颗粒细胞凋亡和代谢失调从而降低卵母细胞质量,对胚胎的形成产生负面影响。玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）是畜禽养殖业中常见的造成卵巢颗粒细胞损伤的霉菌毒素,且缺少有效治疗药物。因此,本试验用ZEA造成小鼠卵巢颗粒细胞损伤,探究咖啡酸对ZEA诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用。通过机械法分离小鼠卵巢颗粒细胞;运用间接免疫荧光法对分离出的细胞进行鉴定;使用MTT法测定咖啡酸对正常小鼠卵巢颗粒细胞活性的影响;选取200、100和50 μg·mL^-1咖啡酸分别与ZEA共处理颗粒细胞,同时设置细胞对照组和ZEA模型组,24 h后显微镜观察细胞形态及贴壁情况,MTT法检测细胞活力;qRT-PCR技术检测caspase-3 mRNA的表达;Western blot检测cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白水平。结果发现,FSHR阳性染色大量出现在试验组细胞胞浆中,提示分离到的细胞是小鼠卵巢颗粒细胞;咖啡酸对卵巢颗粒细胞没有毒性作用且细胞活力均在90%以上;与空白对照组细胞相比,ZEA组细胞体积较小,贴壁较差,细胞间隙增大,细胞活力显著降低（P<0.001）,caspase-3 mRNA相对表达量以及cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白表达水平显著升高（P<0.001）,而给予咖啡酸处理后细胞间隙减小,贴壁紧密,细胞活力显著升高（P<0.001）,显著降低ZEA诱导的caspase-3 mRNA含量增加（P<0.001）,显著降低凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达（P<0.001）。本研究发现,咖啡酸可通过抑制ZEA诱导的细胞凋亡,恢复颗粒细胞活性。     

原花青素对玉米赤霉烯酮诱导牦牛颗粒细胞氧化损伤的保护作用研究

旨在探究原花青素（procyanidins,PC）在玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）诱导牦牛颗粒细胞产生氧化损伤后,对颗粒细胞生长增殖、抗氧化性以及激素分泌的影响。本试验选取3～5岁的健康牦牛（n=3）,完成卵巢颗粒细胞的分离培养,并通过免疫荧光染色鉴定颗粒细胞纯度。通过CCK-8法分别比较不同浓度ZEA （0（对照组）、5、10、20、40、60、80和100 μmol·mL^-1）、不同浓度PC （0（对照组）、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100 μg·mL^-1）以及50 μmol·mL^-1 ZEA+5 μg·mL^-1 PC联合处理对牦牛颗粒细胞活性的影响。通过ELISA法检测对照组（未添加ZEA及PC）、50 μmol·mL^-1 ZEA组和50 μmol·mL^-1ZEA+5 μg·mL^-1PC联合处理组牦牛颗粒细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）以及雌二醇（E₂）水平。采用实时荧光定量PCR法检测不同组颗粒细胞中部分增殖生长、凋亡、抗氧化及E₂合成相关基因的表达水平。结果显示,本研究所分离培养得到的细胞表达颗粒细胞标志蛋白FSHR,具有较高的纯度,可以满足后续试验要求。添加不同浓度ZEA后,颗粒细胞活力随着ZEA浓度的升高而显著降低（P<0.05）。在一定浓度范围内（0~5 μg·mL^-1）,随着浓度的上升,PC对颗粒细胞的活力有显著提高作用（P<0.05）,且在浓度为5 μg·mL^-1时对细胞活力的提高作用最明显。与ZEA处理组相比,ZEA与PC联合处理后颗粒细胞的数量增加且细胞活力极显著提高（P<0.05）,颗粒细胞增殖生长相关基因PCNA和IGF-Ⅱ 以及抗凋亡相关基因XIAP和BCL-2的表达显著上调（P<0.05）。相反,促凋亡相关基因BAX和CASP3的表达显著下调（P<0.05）。同时,ZEA+PC联合处理后能显著降低牦牛颗粒细胞活性氧水平并促进颗粒细胞分泌E₂（P<0.05）,颗粒细胞中的抗氧化相关基因SOD2、GPX1及CAT和E₂合成相关基因STAR、CYP11A1及HSD3B的表达量显著上调（P<0.05）。上述结果表明,PC可提高经ZEA处理后颗粒细胞的生长增殖能力,上调颗粒细胞的活力,提高抗氧化能力,降低ROS水平以及提高E₂的分泌水平。综上所述,PC对ZEA诱导的牦牛颗粒细胞氧化损伤有一定保护作用。本研究为ZEA毒性的防治和畜牧业生产中PC的应用提供了一定的研究数据和理论支持。     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制及功能分析

旨在分析组织蛋白酶D（cathepsin D, CTSD）对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理。本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊（n=5）为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP-N3-CTSD,将其导入细胞后在转录与翻译水平验证真核表达效率;通过CCK-8法检测在不同时间段内重组质粒对颗粒细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测重组质粒对颗粒细胞凋亡及周期的影响;随后使用RT-qPCR法在细胞水平检测重组质粒对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3,细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E mRNA表达水平的影响,最后,以多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为功能基因,在转录与翻译水平上验证重组质粒对其mRNA与蛋白表达的影响。双酶切及测序结果证实,黔北麻羊CTSD基因真核表达载体pEGFP-N3-CTSD构建成功,且在转录与翻译水平极显著上调CTSD在颗粒细胞中的表达（P<0.01）;细胞增殖检测结果表明,颗粒细胞中上调CTSD后能够抑制细胞的增殖,其中在12、24、48、72 h对细胞增殖的抑制效率达到极显著（P<0.01）;细胞凋亡检测结果表明,CTSD的过表达能够极显著促进颗粒细胞的凋亡（P<0.01）,且能够显著下调细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达（P<0.05）,极显著上调细胞促凋亡相关基因Bax、Caspase-3的表达（P<0.01）;此外,细胞周期检测发现,pEGFP-N3-CTSD在转染后能够极显著上调G0/G1期与G2/M期的细胞数量（P<0.01）,极显著下调S期细胞数量（P<0.01）,同时能够极显著提高细胞周期相关因子Cyclin A1的表达（P<0.01）,极显著降低Cyclin D2的表达（P<0.01）。RT-qPCR及Western blot检测结果表明,在颗粒细胞中上调CTSD后,能够极显著的下调多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA在转录和翻译水平中的表达（P<0.01）。本研究发现,CTSD的高表达能抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,改变颗粒细胞的周期进程;还能改变细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3与细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E的表达;同时也能够极显著降低颗粒细胞中多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA的表达量（P<0.01）。这提示,CTSD可能通过改变细胞水平相关因子的表达量来调控颗粒细胞的生物学行为以及影响山羊多胎性状候选基因的表达进而间接的成为影响山羊产羔性状的重要因子,本研究为进一步探明CTSD对山羊产羔性状调控机理及对颗粒细胞的影响机制奠定基础。     

藏羊HSP27基因过表达和沉默载体构建及对卵泡发育的功能初步分析

为了深入探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的作用,本研究选择健康的（3~4岁）经产藏母羊6只,屠宰获得卵巢组织进行藏羊HSP27基因克隆,利用生物信息学方法分析HSP27基因CDS区序列,构建HSP27基因过表达及沉默载体,分离培养藏羊卵巢颗粒细胞,将构建的载体按不同分组进行细胞转染试验即空白组、过表达载体组、沉默载体组、阴性对照组,每组设3个复孔。显微镜观察各转染组培养0、24、48、72 h的细胞形态变化及细胞计数,RT-PCR检测各转染组HSP27、GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量。结果,试验成功克隆藏羊HSP27基因,其CDS序列长度为618 bp,编码203个氨基酸。试验成功构建藏羊HSP27基因过表达及沉默载体;将构建的载体转染至卵巢颗粒细胞,随着培养时间的递增各转染组间细胞形态发生改变,过表达载体组细胞由长梭状逐渐变为不规则多边形,细胞核变形分解,沉默载体组细胞周边伪足伸出减少,细胞皱缩大量凋亡;细胞计数结果显示,转染后培养72 h时,沉默载体组细胞数量极显著低于其他3组（P<0.01）,过表达载体组细胞数量显著低于空白组和阴性对照组（P<0.05）。RT-PCR结果显示,过表达载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）,过表达载体组细胞的GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量均极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞Erβ基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）。由此可初步推测,当HSP27基因过表达时能够促进颗粒细胞增殖分化,当沉默HSP27基因时可能会触发颗粒细胞凋亡进而影响卵泡发育,以上研究成果可为HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的功能研究奠定试验基础。     

P7C3-A20对创伤性脑损伤的PC12细胞凋亡和氧化的影响

旨在研究3,6-二溴-beta-氟-N-(3-甲氧基苯基)-9H-咔唑-9-丙胺(P7C3-A20)对大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12细胞)创伤性脑损伤(TBI)的修复作用。将细胞分为对照组(A组)、模型组(B组)、0.03 μmol·L^-1药物治疗组(C组)、0.3 μmol·L^-1药物治疗组(D组)、3 μmol·L^-1药物治疗组(E组)和药物空白组(F组),TBI细胞模型通过使用10 μL枪头划出横竖相间4 mm的直线来制备。使用CCK8试剂盒检测细胞活力,荧光显微镜观察细胞凋亡、活性氧(ROS)情况,荧光定量PCR仪检测半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、血红素氧合酶1(HO-1)、NAD (P) H:醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的mRNA相对表达量。结果显示：TBI造模后细胞活力极显著降低(P<0.01),0.03 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能显著提高TBI后的细胞活力(P<0.05),0.3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能极显著提高TBI后的细胞活力(P<0.01)。TBI造模后细胞早晚期凋亡细胞比例极显著增加(P<0.01),0.03 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能显著减少TBI后的早期凋亡细胞比例(P<0.05),极显著减少TBI后的晚期凋亡细胞比例(P<0.01),0.3和3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能极显著减少TBI后的早晚期凋亡细胞比例(P<0.01)。TBI造模后活性氧细胞比例极显著增加(P<0.01),0.03和3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能显著减少TBI后的活性氧细胞比例(P<0.05),0.3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能极显著减少TBI后的活性氧细胞比例(P<0.01)。0.3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能极显著减少TBI后Caspase-3的mRNA相对表达量(P<0.01),显著提升TBI后Bcl-2、HO-1、NQO1和GCLC的mRNA相对表达量(P<0.05)。P7C3-A20对TBI后的PC12细胞有抗凋亡、减轻氧化应激的修复作用。     

玉米赤霉烯酮对鸡胚成纤维细胞的毒性作用

旨在探究玉米赤霉烯酮(ZEA)对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的毒性作用机制,采用MTT法检测细胞活力变化,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活力,ELISA法检测Caspase-3含量,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,荧光显微镜观察细胞活性氧(ROS)水平,线粒体膜电位变化,RT-qPCR法检测内质网应激(ERs)和细胞凋亡相关基因的mRNA转录水平。结果显示,12.5~50.0 μg·mL^-1 ZEA显著抑制DF-1细胞增殖(P<0.01),且呈时间和剂量依赖性关系。25.0 μg·mL^-1 ZEA处理细胞24 h后,上清液中LDH和Caspase-3含量显著升高(P<0.01);细胞中ROS水平和细胞凋亡数量极显著升高(P<0.01);线粒体膜电位极显著降低(P<0.01)。凋亡相关基因Caspase-3、Bax mRNA转录水平极显著上调(P<0.01),Bcl-2 mRNA转录水平极显著下调(P<0.01);ERs相关基因GRP78、ATF6、ATF4、CHOP、PERK mRNA转录水平极显著上调(P<0.01)。综上表明,ZEA能通过内质网应激途径导致细胞凋亡并对鸡胚成纤维细胞发挥毒性作用。研究结果为深入研究ZEA对鸡细胞的毒性作用和解毒手段奠定基础,对相关禽类疾病治疗具有意义。     

玉米赤霉烯酮对后备母猪子宫和卵巢抗氧化和炎症指标及相关基因表达的影响

试验旨在研究玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）对后备母猪子宫和卵巢抗氧化和炎症指标及相关基因表达的影响。选择胎次和体重（（23.20±0.68）kg）相近的长×大二元后备母猪48头,随机分为4组,每组设12个重复,每个重复1头母猪。对照组（CON组）饲喂基础饲粮,试验组（T1、T2、T3组）饲喂在基础饲粮中分别添加200、800、1600 μg·kg^-1ZEA的试验饲粮。预试期7 d,正试期40 d。结果如下：1）与CON组相比,T3组血清T-AOC和SOD活性显著降低（P<0.05）,MDA水平显著升高（P<0.05）。2）与CON组相比,子宫组织中,T2和T3组T-AOC活性显著降低（P<0.05）,T3组SOD活性极显著降低（P<0.01）,卵巢组织中,T3组T-AOC活性、T2组GSH-Px和SOD活性显著降低（P<0.05）,T3组MDA水平显著升高（P<0.05）。3）与CON组相比,T2组血清TNF-α和IL-4水平显著升高（P<0.05）,T1~T3组血清IL-10水平显著降低（P<0.05）。4）与CON组相比,子宫组织中,T2组IL-1β水平显著升高（P<0.05）,T1和T3组IL-10水平显著降低（P<0.05）。卵巢组织中,T2组TNF-α水平显著升高（P<0.05）,T1~T3组IL-4水平显著升高（P<0.05）。5）子宫组织中,T3组Cu/Zn-SOD mRNA的相对表达显著低于CON组（P<0.05）,T2组IL-1β mRNA的相对表达显著高于CON组（P<0.05）。6）卵巢组织中,T3组GSH-Px mRNA的相对表达显著低于CON组（P<0.05）,T2组IL-1β mRNA的相对表达显著高于CON组（P<0.05）。综上所述,ZEA能通过抑制SOD和GSH-Px的表达与合成,降低后备母猪子宫和卵巢的抗氧化性能,并引起氧化应激。ZEA能通过促进TNF-α和IL-1β表达与合成引起子宫和卵巢的炎症反应,抑制IL-10的表达与合成从而抑制两组织的抗炎反应。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组（P<0.01）,输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组（P<0.05）,其他组织未达到差异显著性（P>0.05）。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组（P<0.05）,P4含量在12 h显著高于对照组（P<0.05）;超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用（P<0.05）,48、72 h达到极显著促进作用（P<0.01）,并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低（P<0.01）。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

黔北麻羊SRD5A2基因干扰载体构建及其对产羔相关基因表达的影响

旨在探究SRD5A2基因对山羊产羔性状相关基因表达的影响。本研究选择健康的（2~3岁）黔北麻羊经产母羊3只,体重约32 kg,采集卵巢组织并成功培养卵巢颗粒细胞。通过在线软件设计SRD5A2基因的4对siRNA干扰序列和1对阴性对照序列,连接pGPH1/GFP/Neo载体后,将构建成功的干扰载体转染至黔北麻羊卵巢颗粒细胞。利用qRT-PCR方法筛选出干扰效率最佳的载体,检测其对SRD5A2基因表达的影响。运用qRT-PCR检测沉默SRD5A2基因对山羊产羔性状相关基因骨形态发生蛋白15（BMP15）、生长分化因子9（GDF9）、骨形态发生蛋白1B（BMPR-1B）和卵泡刺激素β亚基（FSHβ）表达的影响。结果表明,本试验在培养黔北麻羊卵巢颗粒细胞的基础上,成功构建了黔北麻羊SRD5A2基因的干扰载体,并筛选出shRNA-SRD5A2-1干扰效果最佳（P<0.01）;抑制SRD5A2基因表达后,qRT-PCR检测产羔性状相关基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量均显著降低,BMP15的表达量极显著低于shRNA-NC对照组（P<0.01）,BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量显著低于shRNA-NC对照组（P<0.05）。本研究成功构建了SRD5A2基因干扰载体并转染至卵巢颗粒细胞,发现体外沉默SRD5A2基因可抑制产羔性状相关基因的表达,提示SRD5A2基因与黔北麻羊产羔性状密切相关,本试验结果为进一步研究SRD5A2基因对黔北麻羊产羔性状的调控机制提供了基础。     

布鲁氏菌OMP16对RAW264.7细胞凋亡与免疫活性的影响

旨在研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP16对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡和免疫活性的影响及其机制探讨。以OMP16处理RAW264.7细胞为模型,通过MTT以及Hoechst法检测OMP16对细胞活力的影响,通过Western blot检测Caspase-3、GRP78、CHOP的表达情况,流式细胞术检测OMP16对细胞凋亡的影响以及RT-PCR检测免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α的变化。结果表明,OMP16能够影响RAW264.7细胞的活力,且有浓度依赖性;添加OMP16后能够显著增加凋亡标志因子Caspase-3的表达（P<0.001）,并促进RAW264.7细胞的凋亡;作用24、36 h之后,显著引起内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达;并且能显著上调IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的mRNA表达水平。布鲁氏菌OMP16能够诱导RAW264.7凋亡,OMP16显著引起内质网应激CHOP通路的激活。     

WNT2在绵羊卵泡颗粒细胞的表达及功能研究

旨在探究WNT2在绵羊卵泡颗粒细胞（GCs）中的表达及功能。本研究选取4~6月龄健康母羊20只,采集双侧卵巢,免疫组化技术检测WNT2蛋白在卵泡中的表达定位;qRT-PCR及Western blot技术检测其在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达差异;siRNA沉默GCs中的 Wnt2基因后,qRT-PCR技术检测Wnt2基因及参与经典WNT信号通路关键基因CTNNB1的相对表达量,并测定GCs凋亡情况。结果表明：1）WNT2蛋白在绵羊卵泡内膜细胞、颗粒细胞以及卵丘细胞内均有表达。2）qRT-PCR及Western blot结果基本一致,均表明Wnt2 mRNA及蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞表达差异显著（P<0.05）,且在大卵泡颗粒细胞内表达量显著高于中卵泡颗粒细胞（P<0.05）,中卵泡颗粒细胞内表达量显著高于小卵泡颗粒细胞（P<0.05）。3）基因沉默后,沉默组Wnt2和CTNNB1的表达量均显著低于无义序列siRNA组（NC组）以及空白对照组（P<0.05）,而Wnt2基因沉默组细胞凋亡率显著高于其他两组（P<0.05）。综上表明,WNT2是通过WNT2/CTNNB1信号通路促进绵羊卵泡颗粒细胞生物学功能的。     

Construction of SRD5A2 Gene Interference Vector and Its Effect on the Expression of Lambing Related Genes in Qianbei Ma Goats

The purpose of this study was to investigate the effect of SRD5A2 gene on the expression of genes related to goat lambing traits. In this study, 3 healthy (2-3 years old) and female Qianbei Ma goat with a weight of approximate 32 kg were selected. Ovary tissue was collected and granulosa cells were successfully cultured. Four pairs of siRNA interference sequence of SRD5A2 gene sequence and a pair of negative control sequence were designed by online software. After connecting pGPH1/GFP/Neo vector, the constructed interference vectors were transfected into ovarian granulosa cells of Qianbei Ma goats. The interference vector with optimal interference efficiency was screened by qRT-PCR, and its effect on the expression of SRD5A2 gene was detected. The effects of silencing SRD5A2 gene on the expression of bone morphogenetic protein 15 (BMP15), growth differentiation factor 9 (GDF9), bone morphogenetic protein-1B (BMPR-1B) and follicle-stimulating hormone lactin (FSHβ) were investigated. In this experiment, the interference vector of SRD5A2 gene was successfully constructed on the basis of cultivating ovarian granulosa cells of Qianbei Ma goats. shRNA-SRD5A2-1 interference vector with the optimal interference efficiency was screened out (P<0.01). After inhibiting SRD5A2 gene expression, the expression levels of BMP15, BMPR-1B, GDF9 and FSHβ were significantly reduced. The expression level of BMP15 was extremely significantly lower than that in shRNA-NC control group (P<0.01), and the expression levels of BMPR-1B, GDF9 and FSHβ were significantly lower than those in shRNA-NC control group (P<0.05). In this study, the constructed SRD5A2 gene interference vector was successfully transfected into ovarian granulosa cells. The silencing of SRD5A2 gene can inhibit the expression of genes related to lambing traits, which indicate that SRD5A2 gene is closely related to lambing traits of Qianbei Ma goats, the result will provide a basis for further studies on the regulatory mechanism of SRD5A2 gene on lambing traits in Qianbei Ma goats.     

玉米赤霉烯酮中毒大鼠卵巢组织Bax和Bcl-2的表达

10周龄SD大鼠单剂量腹腔注射5mg／kg玉米赤霉烯酮玉米油溶液，分别于3、6、12、24、48h时剖杀取卵巢组织，检测不同时间卵巢组织Bax和Bcl-2的表达。结果显示，病理组织学观察发现卵巢组织出现不同程度损伤，卵泡颗粒细胞发生凋亡。免疫组化SP法试验组与对照组卵巢组织中均有Bax和Bcl-2的表达，并且随着时间的推进呈现动态变化。Bax在3、6、12h时表达量上调，表达量与对照组比较差异显著（P〈0．05），24、48h时表达量下降，与对照组比较差异不显著（P〉O．05）。3～48h卵巢组织中Bcl-2表达量与对照组比较差异不显著（P〉0．05）。结果表明，大鼠玉米赤霉烯酮中毒可引起卵巢组织的病变及颗粒细胞凋亡，且Bax在玉米赤霉烯酮中毒大鼠卵巢颗粒细胞凋亡中起着重要作用，Bcl-2的作用不明显。     

OPN5对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响

旨在研究视神经蛋白（neuropsin,OPN5）对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响。本研究分别对鸭颗粒细胞进行OPN5过表达质粒和OPN5 siRNA处理72 h （n=6）,应用EdU细胞增殖检测技术、流式细胞技术、Annexin V-FITC、RT-PCR、Western blot及ELISA技术系统地检测颗粒细胞的增殖、凋亡情况及生殖相关基因的mRNA、蛋白水平及激素水平的变化规律。结果显示,OPN5过表达能促进鸭卵泡颗粒细胞增殖,抑制鸭卵泡颗粒细胞凋亡;能极显著地促进GnRHR、FSHR、LHR的表达 ,并抑制GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;能显著或极显著上调StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的mRNA水平（P<0.05或P<0.01）;显著升高OPN5、3β-HSD及CYP19A1的蛋白表达水平（P<0.05）和极显著升高E2、P4分泌水平（P<0.01）,并极显著降低INHβ的水平（P<0.01）。OPN5 siRNA能够显著降低OPN5的表达水平（P<0.01）,抑制卵泡颗粒细胞增殖并促进凋亡,极显著下调GnRH、GnRHR、FSHR、LHR（P<0.01）,促进GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;并极显著抑制StAR、CYP11A1、CYP17A1的表达（P<0.01）;显著降低OPN5、3β-HSD及CYP19A1蛋白表达水平（P<0.05）及极显著降低E2、P4的分泌水平（P<0.01）,并能极显著升高INHβ的水平（P<0.01）。研究表明,OPN5能促进鸭卵泡颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡,促进颗粒细胞中类固醇激素的生成和分泌。     

犬脂肪来源间充质干细胞对重症急性胰腺炎体外内质网应激模型的抗凋亡作用

【目的】 探究犬脂肪组织来源的间充质干细胞(cAd-MSCs)对重症急性胰腺炎(SAP)体外模型的抗凋亡作用,以期为利用干细胞治疗胰腺炎提供理论指导。【方法】 ①用Ⅰ型胶原酶消化分离cAd-MSCs,用流式细胞术鉴定其干细胞标志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD73和CD90的表达,用成脂、成骨和成软骨分化来鉴定其多向分化潜能;②用Ⅰ型胶原酶从小鼠胰腺组织中分离胰腺腺泡细胞(PACs),用实时荧光定量PCR检测PACs及胰腺组织中胰腺导管特异性基因CK19、β-胰岛细胞特异性细胞基因Insulin-1、α-胰岛细胞特异性基因Glucagon及PAC特异性基因PTF-1α、CPA-1、AMY2B的表达;③以10、20 μg/mL脂多糖(LPS),10、100 mmol/L雨蛙肽(Caerulein)以及10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein处理PACs,不添加药物培养的细胞为对照组,培养24 h后使用CCK-8检测PACs存活率,筛选体外构建内质网应激模型的最佳处理组(即模型组,P);用CCK-8检测对照组(Naive)及模型组(P)细胞0、2、4、8、12和24 h的存活率,Western blotting检测P组细胞内质网应激相关蛋白的相对表达量;④为确定cAd-MSCs对PACs的作用方式,试验分为PAC组(仅PACs,Naive)、P组、间接共培养组(IC)、直接共培养组(构建PAC模型时与cAd-MSCs直接共培养,DC),用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF-α)基因在PACs中的表达水平;⑤在间接共培养系统中,将细胞分为空白对照组(仅PACs,Naive)、对照组(PACs与cAd-MSCs共培养,C)、P组及试验组(药物处理的PACs与cAd-MSCs细胞共培养,T),细胞培养12 h后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting检测各组细胞内质网应激相关基因及蛋白表达水平的变化,并用TUNEL法检测各组细胞的凋亡情况。【结果】 ①分离培养的cAd-MSCs呈现成纤维样细胞形态,高表达干细胞标志物CD29、CD44、CD73及CD90,不表达CD34和CD45,且具备成脂、成骨、成软骨分化能力;②分离的原代PACs呈鹅卵石样,与胰腺组织相比较,AMY2B、CPA1、PTF1α基因的相对表达量均显著增加(P<0.05),CK19、Glucagon、Insulin-1基因的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。③与对照组相比,10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein组细胞存活率极显著降低(P<0.01),因此选为构建内质网应激模型的最佳处理组。与对照组相比,4 h时P组PACs的细胞存活率显著降低(P<0.05),8、12、24 h均极显著降低(P<0.01);Western blotting检测结果显示,Grp78、CHOP、Caspase-12蛋白的表达水平自4 h开始均极显著增加(P<0.01)。④与Naive组相比,P组TNF-α基因的表达水平极显著增加(P<0.01);与P组相比,IC和DC组TNF-α基因表达水平均极显著降低(P<0.01),后续用间接共培养系统进行试验。⑤在间接共培养系统中,与P组相比,T组Grp78、Caspase-12和CHOP mRNA及蛋白的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。TUNEL检测结果显示,T组阳性细胞数明显减少。【结论】 本试验成功构建SAP体外内质网应激模型,且证明cAd-MSCs对PACs内质网应激具有调控及保护作用。     

玉米赤霉烯酮致PC12细胞自噬流阻滞的相关作用机制

旨在研究玉米赤霉烯酮(ZEA)对PC12细胞自噬流阻滞的作用机制,以PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤系)为研究材料,以不同浓度的ZEA处理24 h,CCK-8检测细胞存活率,并筛选ZEA最适浓度,分别设置Con组、15 μmol·L-1 ZEA 组、30 μmol·L-1 ZEA 组,Western blot 检测自...     

不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响.本研究分别用不同浓度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng ? mL-1)处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h(n=3),观察细胞的生长状态,通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖,并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、Cycli...