微生物菌群培养组学在动物医学中的应用

实验室条件下可培养的微生物约占自然界中微生物总数的1%，这限制了人们对99%未知微生物的认识和利用，而研究表明，那些“不可培养的微生物”是可以被开发和利用的，未能被纯培养的微生物才是未知微生物的主体。微生物培养组学探索利用多种培养条件和长时间的培养，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）和16S核糖体RNA（rRNA）测序可以大规模鉴定各种微生物，同时利用全基因组测序和宏基因组测序手段对未知微生物进行深入分析。本文综述了国内外近年来微生物菌群培养组学在反刍动物胃肠道、禽类盲肠及家畜鼻腔微生物菌群研究中的最新进展，探讨将动物体内菌群培养组学方法应用于动物疾病防治领域的可行性。作为一个新兴的研究方法，尽管该培养组学还存在一些不够成熟的方面，但它的发展前景十分广阔，微生物菌群培养组学方法和其他研究方法的互补已经逐渐成为发展兽医微生物学新的突破口。     

培养组学在动物肠道微生物应用的研究进展

肠道微生物被称为动物的“隐藏免疫器官”,不仅能参与宿主代谢还能影响宿主的免疫系统,对维持机体健康至关重要。作者主要介绍了培养组学的发展历程及其对动物肠道微生物研究的重要意义、传统微生物培养方法和分子生物学方法在研究微生物时各自的优、缺点。培养组学是基于传统微生物培养方法同时采用多种培养条件进行微生物培养,再辅以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因测序技术建立的一种新型微生物分离、鉴定方法,该方法将传统微生物培养技术与分子生物学技术的优点融为一体。该方法在挖掘“新微生物”的研究中,具有发现、找到并获得的优势;在微生物的研究中可定制分离目标菌株进行验证,并能通过丰富注释清楚地了解肠道微生物组。此外,分析了培养组学分别在家禽肠道、猪肠道、反刍动物肠道等动物肠道的研究应用现状,提出了环境条件对肠道微生物的影响,如人类接触对肠道菌群的影响、同物种不同性别肠道菌群的差异,以期为培养组学在动物肠道微生物的研究运用中提供参考。     

猪肠道细菌培养组学研究进展

猪肠道菌群是由所有定殖在猪肠道里的大量细菌、病毒、真菌和古菌等构成的集合.已有研究表明,很多疾病以及猪重要经济性状都与肠道菌群有关.目前,肠道菌群研究使用较多的技术是16S rRNA基因测序和宏基因组测序,但这些技术并不能了解具体菌株的实际功能和生理特性.肠道细菌的分离培养具有特殊重要的意义.近几年来,肠道细菌的培养取...     

哺乳仔猪断奶前后肠道微生物培养组学研究

近年来国内外研究人员通过下一代测序和分离培养技术,结合宏基因组学相关的生物信息学手段证实了猪肠道微生物的组成及其代谢物活性对宿主的健康具有重要作用.受限于传统培养方法,猪肠道中大多数细菌仍无法培养,因此,为了突破研究人员研究宿主-菌株相互关系及益生菌株开发应用的限制,本研究对仔猪断奶前后回肠和结肠内容物微生物进行高通量...     

益生菌剂对仔猪肠道菌群的影响

为研究益生菌剂对仔猪肠道菌群的影响,选择60头7.5 kg左右的"杜洛克猪×长白猪×大白猪"原种猪,随机分成2组,每组3个重复,每个重复10头。将仔猪分为试验组和对照组,对照组饲喂基础日粮,试验组饲喂基础日粮+0.1%益生菌剂,检测各组仔猪生产性能及肠道菌群等。试验结果表明,益生菌制剂能显著降低仔猪腹泻率(P<0.05),促进仔猪的生长;大肠杆菌和肠球菌是仔猪肠道非常住菌群(过路菌),乳酸杆菌、双歧杆菌、产气荚膜梭菌为常住菌群;益生菌剂能极显著减少仔猪肠道的好氧菌(P<0.01),极显著增加仔猪肠道的厌氧菌、双歧杆菌和乳酸杆菌(P<0.01),显著降低仔猪肠道的产气荚膜梭菌(P<0.05)。因此,饲料中添加益生菌剂能有效改善仔猪肠道菌群。     

T-RFLP分析技术在肉鸡肠道微生物研究中的应用

本文阐述了末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析技术的基本原理和技术路线,讨论了应用T-RFLP分析技术相对于应用传统方法研究肉鸡肠道微生物的优势,总结了应用T-RFLP分析技术研究肉鸡肠道微生物的发展历程,分析了应用T-RFLP分析技术研究肉鸡肠道微生物存在的问题及解决方法,并对其应用前景进行了展望.     

应用高通量测序技术分析青海牦牛引进山东后瘤胃菌群的变化

试验旨在探讨不同的饲养环境及日粮结构对牦牛瘤胃菌群结构的影响，应用高通量测序技术分析了青海牦牛引进山东后的瘤胃菌群变化情况。结果表明，青海牦牛瘤胃液可见物种（Observed species）及Chao1指数（Chao1 index）与引进牦牛瘤胃液相比差异极显著（P<0.01），ACE指数差异显著（P<0.05）；青海牦牛菌群丰度显著高于引进牦牛，说明青海牦牛引进山东后瘤胃菌群丰度发生了显著变化，而引进前后牦牛瘤胃液香浓指数（Shannon index）以及辛普森指数（Simpson index）差异不显著（P>0.05），说明青海牦牛引进山东后瘤胃菌群多样性未显著改变。测序数据表明，牦牛瘤胃液中丰度较高的菌群依次是拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门、互养菌门、软壁菌门、纤维杆菌门；青海牦牛引进山东后菌群结构比例变化显著的门是浮霉菌门和装甲菌门（P<0.05），变化显著的属是颤杆菌克属和帕匹杆菌属（P<0.05）。数据分析得出，拟杆菌和理研菌科在青海牦牛瘤胃液中起重要作用，而普雷沃氏菌科、琥珀酸弧菌科和产气单胞菌在引进山东牦牛瘤胃液中起主要的作用，推测饲养环境及日粮结构的改变导致了瘤胃菌群及其相关功能的改变。本研究为地域和日粮结构的变化对牦牛瘤胃菌群结构的影响提供了理论依据。     

单胃动物肠道菌群与宿主肠道免疫系统的互作关系及可能机制

单胃动物的肠道中存在着庞大而复杂的菌群,它们与宿主肠道免疫系统协同进化。肠道细菌及其代谢产物在维持肠道稳态方面发挥着重要的作用。正常的肠道菌群能促进免疫系统发育,参与维持宿主免疫功能,协同拮抗病原菌的增殖和入侵。反过来,宿主肠道免疫系统对肠道菌群又有制约和调控作用,如对正常共生菌表现为免疫耐受,对病原菌表现为免疫排斥。一旦这种动态平衡被破坏,就会导致疾病的发生。本文综述了单胃动物肠道菌群与宿主肠道免疫系统的相互关系,并基于现有的研究结果,对其可能的互作机制做了较为系统的总结。     

鸭疫里默氏菌感染对鸭肠道菌群结构的影响

试验旨在分析鸭疫里默氏菌（RA）感染不同时期鸭肠道菌群结构变化规律，探讨鸭疫里默氏菌对鸭肠道微生物的影响及引起鸭致病的可能机制。采用细菌16S V4-V5区扩增通用引物，扩增鸭疫里默氏菌未感染组（鸭疫里默氏菌感染0 d组），鸭疫里默氏菌感染后1、2、3、5、9和14 d的鸭直肠内容物样本DNA，将扩增得到的产物进行DNA建库后基于Ion S5^TMXL测序平台测序。测序得到的Raw Reads数据总量为4 710 688条序列，平均每个样本84 119条序列。共注释到数据库的操作分类单元（OTUs）数目为4 528。Alpha多样性分析结果表明，菌群多样性指数Shannon和Simpson在鸭疫里默氏菌感染组和未感染组间差异不显著（P>0.05），菌群丰富度指数Chao1、Ace、Observed-species和PD-whole-tree在鸭疫里默氏菌感染后0~5 d逐渐降低，从5~14 d又逐渐增加，尤其在鸭疫里默氏菌感染后3和5 d均显著低于未感染组（P<0.05）。Beta多样性分析表明，未感染组与6个时间点的感染组间菌群差异均显著（P<0.05），其中，未感染组与感染后3 d的物种差异最大，之后依次为感染后2、5、9、1和14 d。物种丰度聚类热图显示，在未感染组和不同时间感染组，物种丰度相对较高的微生物菌属均不同。在门水平，鸭疫里默氏菌感染组主要以厚壁菌门（Firmicutes）、unidentified-Bacteria、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）及变形菌门（Proteobacteria）为主；在属水平，Bacteroides在感染组和未感染组均为优势菌属，感染组中弯曲杆菌属（Campylobacter）和梭杆菌属（Fusobacterium）明显增加。本试验分析了鸭疫里默氏菌未感染组和感染不同时间组肠道菌群的差异，寻找到一些特征菌属，可为鸭疫里默氏菌的致病性研究提供理论依据。     

家畜消化道菌群的分子生物学研究方法

消化道菌群多样性对于维持家畜机体健康起着至关重要的作用,因此,对家畜消化道中定植菌群的种类和功能进行分析就显得尤为关键。由于所有动物的消化道是厌氧环境,所以在体外的好氧环境中,有些菌种不易培养,而这些菌种信息的缺失,会导致消化道优势菌群的分析结果出现偏差。借助一些广泛应用的分子生物学研究方法,可以避免这种情况的发生。这些方法主要是测序法和定性定量分析法。测序法包括指纹图谱法和高通量测序法,定性定量分析法包括荧光原位杂交法和实时荧光定量PCR法。这些方法均基于分子生物学水平,可避免菌体培养步骤,直接分析消化道菌群的组成和功能。综述了上述方法的原理以及各自的优点和缺点,并对它们在动物消化道菌群多样性分析中的应用进行了讨论,以期为研究动物消化道微生物时不同分子生物学方法的选择和联合使用提供参考。     

Microbiology of various liver products]

The proportions of mesophilic, thermophilic and psychrophilic microorganisms were investigated in the total number of microbes and aerobic sporogenic microorganisms in delicatessen liver sausages and liver cheeses. At the same time the content of ammonia and the pH of the products were determined. The largest part of the microflora comprised mesophilic microorganisms, 10 to 25% of which belonged to the sporogenic microflora. The incidence of staphylococci, enterococci and coliform microorganisms was also studied. The total number of microbes contributed to the ammonia content in the products, however, no intercorrelation was statistically proved. In the case of pH no relationship between its value and the number or kind of investigated microorganisms was found. All the indicators were followed in the raw material, in the finished products after heat processing and in products stored at refridgerator and room temperatures for one week.     

肉牛粪便正常菌群研究

研究采用微生态学检测方法，对健康牛粪便中的正常菌群进行了定性，定量分析。结果证明；健康牛消化道中的类杆菌，双歧杆菌，乳杆菌，消化球菌为优势菌群，而肠杆菌，梭杆菌，优杆菌含量则较少。     

Modulation of broilers’ caecal microflora and metabolites in response to a potential probiotic Bacillus amyloliquefaciens

Studies have found that a dietary supplement of Bacillus amyloliquefaciens improved the growth performance, increased the nutrient digestibility of hosts and modulated the intestinal microflora. A total of 360 1‐day‐old Ross broilers were randomly divided into three treatments: a control group with a basal diet, an antibiotic group with a basal diet and added colistin sulphate, and a probiotics group with a basal diet and added Bacillus amyloliquefaciens. The HiSeq high‐throughput sequencing analysis of 16S rRNA was used to investigate the differences in birds’ caecal microflora, and metabolomics was used to analyse changes in caecal metabolites. Results showed that the supplementation of Bacillus amyloliquefaciens significantly improved the BW and ADG compared with the control birds. Results of sequencing indicated that (i) 645, 670, 596 unique operational taxonomic units (OTUs) were found in birds supplemented with Bacillus amyloliquefaciens on day 7, 21 and 42, separately, (ii) due to the diversity and relative abundance of the birds’ caecal microflora, the OTUs of the caecal microflora clustered according to age and treatment, except on day 42, (iii) among the six predominate families (Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Enterobacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Lactobacillaceae and Rikenellaceae), the supplementation of Bacillus amyloliquefaciens significantly increased Enterobacteriaceae on day 42, (iv) Bacillus amyloliquefaciens increased the relative abundance of Faecalibacterium and Ruminococcus on day 21, increased the Faecalibacterium and Blautia and decreased the Ruminococcus on day 42. The metabolomics of caecal metabolites showed that the dietary Bacillus amyloliquefaciens changed the caecal metabolites involved of amino acid metabolism and glyceride metabolism, and the antibiotics changed the caecal metabolites that were related to carbohydrates and amino acid metabolism on day 21.     

大薯部分替代玉米对文昌鸡盲肠微生物区系和短链脂肪酸含量的影响

本试验旨在研究大薯部分替代玉米对文昌鸡盲肠微生物区系和短链脂肪酸含量的影响,探讨大薯替代玉米作为文昌鸡饲料开发的可行性。选择288只健康、体重相近的50日龄文昌鸡母鸡,随机分成4组,每组4个重复,每个重复18只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础日粮;Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组为试验组,分别饲喂以大薯替代基础日粮中10%、15%、20%玉米的等能等氮试验日粮。试验期28 d。结果表明,经过14 d饲养试验,大薯替代不同比例玉米对文昌鸡盲肠微生物区系无显著影响(P>0.05),对文昌鸡盲肠内容物短链脂肪酸含量影响显著(P<0.05),其中Ⅲ组丙酸、丁酸含量显著低于对照组(P<0.05)。随着饲养期延长至28 d,大薯替代不同比例玉米对盲肠微生物区系和短链脂肪酸含量影响显著(P<0.05),其中Ⅱ组大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.05),Ⅲ组粪链球菌、总厌氧菌数量分别显著和极显著高于对照组(P<0.05;P<0.01);Ⅰ组丁酸和丙酸含量分别显著和极显著低于对照组(P<0.05;P<0.01)。综上所述,大薯部分替代玉米能提升盲肠有益菌群数量,但短期饲喂会降低短链脂肪酸生成,长期饲喂对短链脂肪酸生成无显著影响。在本试验条件下,建议大薯替代玉米比例以15%为宜。     

黄芪茎叶对断奶仔猪盲肠微生物区系的影响

本试验旨在探讨日粮中添加不同比例黄芪茎叶对断奶仔猪盲肠微生物区系的影响。选用24头健康的长×大二元杂交仔猪,按体重随机分成对照组、2.5%黄芪茎叶组、5%黄芪茎叶组和7.5%黄芪茎叶组4组,每组3个重复,每个重复2头仔猪,试验期为28 d。试验结束后,采用高通量测序方法对仔猪盲肠内容物进行分析。结果表明:断奶仔猪盲肠微生物的多样性随黄芪茎叶的添加量不同发生改变,其中2.5%组的微生物多样性最高,盲肠内容物中微生物菌群以Firmicutes(厚壁菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)为主,占总含量92%以上;在属水平上,2.5%黄芪茎叶组与7.5%黄芪茎叶组的优势菌属数量最高为11种,其中Prevotella菌属的丰度最高。综上所述,在仔猪日粮中添加适量的黄芪茎叶,可降低盲肠p H及提高微生物多样性,有利于断奶仔猪的健康生长。     

猪不同生长阶段肠道微生物组的变化及其影响因素

肠道是机体重要的消化与免疫器官,维持肠道健康对猪的生长发育和疾病预防具有十分重要的意义。高通量测序技术的发展极大地促进了人们对肠道微生物功能的认知,猪肠道微生物组的研究正逐步成为热点。目前,尽管对某一生长阶段猪的肠道微生物组已有较为深入的理解,但仍缺乏有关商品猪整个生命周期范围内肠道微生物组动态变化的全面纵向研究。而从出生到出栏,猪在整个生长周期内的肠道微生物组并不是一成不变的,是一个动态的发育过程。作者综述了猪哺乳期、断奶期、育肥期和妊娠期等从出生到育肥过程中不同阶段肠道微生物组的纵向变化及其主要影响因素：一方面,肠道微生物群落结构的显著变化主要发生在断奶期;另一方面,虽然肠道微生物组成随着时间始终在不断变化,但仍有一部分优势菌是一直存在的,这部分优势菌被称为核心菌群,而只在特定时期才出现的菌只是胃肠道中的"过客",也最易受外界因素影响。肠道微生物组与多种因素相关,如年龄、饮食、环境、抗生素使用等,其中饮食对塑造肠道微生物起到至关重要的作用。本文可为理解猪在不同生长发育阶段肠道微生物的动态变化规律及改善猪生长性能和健康水平的微生物技术手段提供理论参考。     

枯草芽孢杆菌及其发酵豆粕对蛋鸡肠道菌群和粪便中N、S含量的影响

研究旨在探讨枯草芽孢杆菌及其发酵豆粕对海兰褐蛋鸡日粮、胃肠道内容物和粪便中pH、微生物菌群数量和N、S含量的影响。选取486只健康海兰褐蛋鸡,随机分为对照组(玉米-豆粕基础日粮)、试验1组(添加0.05%枯草芽孢杆菌)和试验2组(添加2.5%枯草芽孢杆菌发酵豆粕),采集胃肠道内容物和粪便样本,以稀释涂平板法测定菌群数量,并分别以凯氏定氮法和硝酸镁法测定N、S含量。结果显示,枯草芽孢杆菌及其发酵豆粕能减少日粮中大肠杆菌等有害菌群数量,显著增加枯草芽孢杆菌和乳酸菌等有益菌群数量(P<0.05),降低pH值(P<0.05);饲喂56d后,蛋鸡胃肠道内容物和新鲜粪便中大肠杆菌等有害菌群数量显著下降(P<0.05),乳杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等有益菌群数量显著增加(P<0.05),pH值显著下降;将粪便自然放置7d后,其N损失显著下降(P<0.05)。结果表明,枯草芽孢杆菌及其发酵豆粕能增加蛋鸡日粮中有益菌群数量,改善肠道微生态系统,减少粪便放置过程中的N损失。     

不同外源寡糖对崂山奶山羊瘤胃微生物区系的影响

本试验旨在研究不同外源寡糖对奶山羊瘤胃微生物区系的影响。试验选用 ６只平均体重为（３２．８０±２．４５）ｋｇ、装有永久性瘤胃瘘管的崂山奶山羊,采用分期分组试验设计。各组羊饲喂基础饲粮（对照组）以及分别在基础饲粮中添加 １％甘露寡糖（ＭＯＳ组）、半乳甘露寡糖（ＧＭＯＳ组）、寡木糖（ＸＯＳ组）、低聚异麦芽糖（ＩＭＯ组）、果寡糖（ＦＯＳ组）的试验饲粮。共进行４期试验,每期 ２３ｄ,其中预试期 １４ｄ,正试期 ９ｄ。于晨饲前（０ｈ）,晨饲后 ２、４、６、８ｈ以及晚饲前（晨饲后 １０ｈ）采集瘤胃液,测定瘤胃液中细菌总数以及纤维素分解菌、原虫和真菌数量。结果表明：与对照组相比,试验组瘤胃液细菌总数趋于增加,仅晨饲前 ＭＯＳ组显著提高（Ｐ＜０．０５）;试验组瘤胃液纤维素分解菌数量有所提高,其中 ＭＯＳ组（０ｈ）、ＧＭＯＳ组（０、２、４ｈ）、ＦＯＳ组（０、２、４ｈ）显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）;试验组瘤胃液原虫数量有所提高,其中 ＭＯＳ组（２和 ４ｈ）、ＸＯＳ组（４ｈ）显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）;试验组瘤胃液真菌数量有所提高,其中ＧＭＯＳ组和 ＦＯＳ组（０ｈ）极显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）,ＭＯＳ组（２ｈ）、ＩＭＯ组（２ｈ）、ＦＯＳ组（２ｈ）、ＭＯＳ组（４ｈ）、ＦＯＳ组（６ｈ）显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）。细菌总数、纤维素分解菌和原虫数量呈先下降后上升趋势,真菌数量呈先上升后下降趋势。本试验条件下,添加不同外源寡糖对瘤胃微生物影响有所差异,其中甘露寡糖、半乳甘露寡糖和果寡糖对瘤胃液纤维素分解菌、原虫和真菌的增殖作用较明显。     

仔猪消化道菌群变化与仔猪腹泻的关系

通过对健康和腹泻仔猪消化道内(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)7个部位菌群取样后进行培养和分离鉴定，研究健康和腹泻仔猪间不同菌群关系的差异，揭示维持仔猪的正常消化代谢优势菌群的组成、比例和结构。结果发现：双歧杆菌和乳杆菌是健康仔猪消化道内数量最多的菌群，为优势菌群；韦荣氏球菌、肠杆菌、肠球菌在仔猪发生腹泻时明显增多，为有害菌群。有害菌群的增多抑制了有益优势菌群的生长，从而导致仔猪发生腹泻。     

复合益生菌对肉鸡肠道微生物区系的影响

【目的】 探究干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌组成的复合益生菌对黄麻肉鸡生产性能及肠道微生物区系的影响, 为复合益生菌在肉鸡生产中的应用提供理论基础。【方法】 将200只1日龄雄性黄麻肉鸡随机分为2组, 每组5个重复, 每个重复20只。复合菌制剂(干酪乳杆菌∶嗜酸乳杆菌∶乳双歧杆菌=1∶1∶2)按1%比例补充于益生菌组肉鸡的饮用水中, 以正常饮水的肉鸡为对照。在42 d时以重复为单位测定肉鸡的生长性能指标, 并进行肠道菌群高通量测序分析。【结果】 与对照组相比, 益生菌组肉鸡的平均日增重显著增加(P<0.05), 平均日采食量、屠宰率和全净膛率增加, 料重比降低, 但差异不显著(P>0.05);益生菌组肠道菌群的OTU总数及回肠的Sob、Chao、Pd、Shannon、Shannoneven指数均降低, Simpson指数升高, 差异均不显著(P>0.05);厚壁菌门在肉鸡肠道中丰度最高, 具主体地位。较对照组而言, 益生菌组回肠中未见梭菌属, 厚壁菌门和乳球菌属的丰度均显著或极显著增加(P < 0.05; P < 0.01), 放线菌门和葡葡萄球菌属的丰度均显著或极显著降低(P < 0.05; P < 0.01), 盲肠中毛螺菌科的丰度显著增加(P<0.05)。【结论】 复合益生菌可通过增加肉鸡回肠乳杆菌属丰度、降低病原菌丰度来改善肠道菌群的组成、功能和多样性; 同时通过增加盲肠毛螺菌科丰度来提高肠道发酵降解非淀粉多糖的能力, 进而提高饲料利用效率, 促进肉鸡生长。