水禽StAR基因克隆、表达及其对睾丸发育的影响

旨在获取水禽StAR基因的结构和组织表达规律,初步了解其对水禽睾丸发育的影响。本研究选取山麻鸭和狮头鹅的下丘脑和睾丸组织为材料,克隆StAR基因,并采用实时荧光定量PCR方法检测该基因在山麻鸭和狮头鹅不同组织中的表达规律,并进一步比较该基因在不同时期鹅睾丸组织中的表达差异。本试验克隆获得鸭StAR基因3个转录本（dSTAR-A、dSTAR-B和dSTAR-C）,dSTAR-A和dSTAR-B编码序列相同,编码283个氨基酸,而dSTAR-C编码238个氨基酸;获得鹅STAR基因两个转录本（gSTAR-A和gSTAR-B）,均编码283个氨基酸。比对分析发现,鸭和鹅StAR氨基酸序列与其他禽类的同源性较高,在物种间的保守性高。StAR基因在鸭和鹅的各个组织中均有表达,其中在睾丸中表达量最高,在腹脂、胸肌和腿肌也有较高的表达水平。比较不同时期公鹅的睾丸,发现该基因在3岁龄时表达水平极显著高于1和52日龄（P<0.01）,且在成年公鹅繁殖期的表达水平极显著高于休产期（P<0.01）。结果表明,StAR基因可能是鹅睾丸发育所必需的关键基因,并参与成年公鹅繁殖性能的调控。     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

GnIH基因克隆、表达及对幼龄公兔生殖激素的影响

旨在获得兔促性腺激素抑制素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)基因,检测其在不同组织和不同发育阶段下丘脑中的表达水平,研究其对幼龄公兔生殖激素分泌的影响。本研究以90日龄健康闽西南黑兔公兔为研究对象,采用RACE技术(rapid-amplification of cDNA ends)从下丘脑组织中克隆出GnIH基因,并对序列进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法(real-time quantitative PCR,qPCR)检测GnIH基因mRNA在90日龄公兔不同组织表达水平(n=5)及11、30、60、90、120、150日龄公兔下丘脑中的表达水平(n=6);连续10 d向80日龄公兔分别注射0、0.5、5和50μg鹌鹑GnIH相关肽(n=10)。第11天早上采集耳静脉血液后,屠宰公兔,采集睾丸组织,分别检测血清中生殖激素浓度(GnRH、FSH、LH、INHB和T)和睾丸组织中睾酮合成相关酶基因(StarR、3β-HSD和p450scc)mRNA的表达水平。结果表明,兔GnIH基因cDNA全长904 bp,包含5′UTR 41 bp...     

人SOD基因的克隆与原核表达

超氧化物歧化酶(SOD)是机体内超氧自由基的天然清除剂,在抗衰老、抗辐射、抗逆境,消炎、抑制肿瘤和癌症,以及自身免疫疾病的治疗方面有很重要的作用。我国目前主要从血液中提取SOD,有关重组人SOD的研究较少。文章通过RT-PCR方法克隆得到人SOD基因,并成功构建其原核表达载体pET-16b-SOD,为通过基因重组技术生产人SOD创造了条件。     

猪细小病毒NS1基因的克隆及表达

根据Bergeron等报道的猪细小病毒基因组序列设计引物，在下游引物中引入BglⅡ酶切位点以便于构建表达载体。利用PCR技术扩增得到NS1全基因，将其克隆到pMDl8-T载体中进行序列测定并分析，进而构建重组转移载体pFast-NS1，在DH10Bac大肠杆菌中与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)基因组(Bacmid)发生同源重组，获得重组穿梭载体Bacmid—NS1，经脂质体介导转染Sf9细胞后，得到重组杆状病毒(AcNPV-NS1)。SDS—PAGE、West-ern-blotting分析可见大小约为84000的特异性带，表明NS1蛋白在杆状病毒：Bac-To-Bac表达系统中成功地实现了表达。从而为研究其结构与功能创造了条件。     

水牛缝隙连接蛋白43基因克隆及表达

本研究克隆了水牛缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,对Cx43基因在水牛不同组织和不同发育阶段卵泡中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了水牛Cx43基因序列,其中编码区全长1152 bp,编码383个氨基酸,蛋白质理论分子质量43.13 ku,等电点为8.88。多重序列比对结果显示,水牛Cx43核苷酸序列与牛、羊、猪、马和人相应序列的同源性分别为99%、98%、94%、93%和92%,系统进化树分析结果推测,Cx43基因在不同物种进化过程中具有高度保守性;对水牛Cx43蛋白的二级和三级结构分析发现,其具有缝隙连接蛋白的特有结构。定量RT-PCR结果显示,Cx43在水牛卵巢组织中相对表达量最高,睾丸、肾脏、心脏和皮肤次之,肝脏和大脑表达量较低。免疫组化结果发现,Cx43蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,Cx43蛋白随卵泡发育表达逐渐增强。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其原核表达

根据鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因序列和表达栽体pBV221的多克隆位点，设计了1对引物。以ILTV疫苗株基因组为模板，应用PCR扩增出gB基因片段，然后将其定向克隆于原棱表达载体pBV221中，构建了重组质粒pBV-gB。重组质粒转化到受体菌DH5α中，得到阳性重组菌株DH5α(pBV-gB)。该菌株在温控诱导下，SDS-PAGE电泳可见表达的特异蛋白。ELISA检测证明．表达的蛋白具有较好的反应原性。     

猪γ-干扰素全基因克隆及原核表达

利用RT-PCR技术,从ConA活化的猪外周血淋巴细胞中扩增出γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ) cDNA,克隆到pMD18-T载体中进行测序后,与原核表达载体pET32a(+)重组,表达含His×6的IFN-γ重组蛋白;测序结果与GenBank中已发表的序列进行比对,核苷酸同源性在98.6%~100.0%之间,氨基酸同源性在96.4%~99.4%;经SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量约为27 ku,主要存在于包涵体中,且具有良好的免疫学活性,为进行γ-干扰素深入的研究奠定了基础。     

香蕉MaUFGT1基因克隆及表达分析

从香蕉果肉中克隆得到了一个类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因UFGT1基因全长,利用生物信息学方法分析了该基因的基本理化性质、蛋白二级结构、亚细胞定位、亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、基因结构、保守结构域、系统进化关系,并对该基因的时空表达模式及香蕉果实不同发育阶段进行了表达分析。结果表明：UFGT1基因长1380bp,编码459个氨基酸的蛋白质;该蛋白为疏水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,蛋白无跨膜结构,不存在信号肽;MaUFGT1在不同组织中均有表达,但表达丰度存在差异;MaUFGT1在‘巴西’和‘香粉1号’两个不同品种中,随着果实成熟,其表达量逐渐上升,后期‘香粉1号’明显高于‘巴西’。这些结果表明,MaUFGT1可能参与了香蕉果肉黄酮类物质的合成,为进一步研究MaUFGT基因的功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因.     

鸡HMIT基因的克隆与表达分析

旨在克隆鸡H+/肌醇转运蛋白（H+/myoinositol transporter,HMIT）基因的转录序列,并检测HMIT基因在鸡不同组织中的表达情况,以及外源胰岛素处理对HMIT基因相对表达量的影响。本研究以AA肉鸡为试验动物,采用RT-PCR技术克隆鸡HMIT基因全编码区序列,采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性,利用荧光定量PCR检测HMIT基因在大脑、肝、腹脂、腿肌、心、肾、空肠和回肠等组织中的表达情况,并检测其在肾和大脑中进行胰岛素处理120和240 min后的表达情况。结果表明,以NCBI预测的鸡HMIT（XM_001232939.5）序列为模板设计引物,成功克隆出鸡HMIT基因（1 694 bp,GenBank登录号：MN708211）。克隆的鸡HMIT编码区全长1 380 bp,相比XM_001232939.5预测的编码序列少561 bp,预测编码含有459个氨基酸组成的蛋白。核苷酸和氨基酸序列比对发现,鸡HMIT在物种间高度同源,共线性分析显示,HMIT所在的1号染色体区域在物种间也是高度保守的。HMIT编码的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质,其二级结构和三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。跨膜结构分析显示,鸡HMIT存在8个明显的跨膜结构域。亚细胞定位结果表明,鸡HMIT蛋白分布于质膜（52.3%）、内质网（21.7%）、液泡（17.4%）、线粒体（4.3%）和高尔基体（4.3%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HMIT基因在鸡大脑和肾表达量最高,且显著高于其他组织（P<0.05）。胰岛素处理240 min后,HMIT在肾和大脑中的表达量都显著低于PBS对照组（P<0.05）。本研究克隆获得了鸡HMIT的全编码区,生物信息学分析及组织表达特性研究为深入探索鸡HMIT基因的生理功能和调控机制奠定基础。     

鸡降钙素基因克隆及其真核表达质粒的构建

采集200日龄新扬州产蛋鸡腮后腺组织,直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物进行克隆、测序,获得新扬州鸡降钙素(CT)基因序列。测序表明,CT基因核苷酸长度为417bp,编码139个氨基酸。与GenBank上发表序列相比较,核苷酸同源性为99.8%,在第135位处存在G→C的有义突变。与从GenBank下载读取的红点鲑、大马哈鱼、河豚、斑马鱼、人、家鼠、绵羊、犬8个物种序列进行比较分析,核苷酸同源性分别为74.0%、63.3%、59.5%、55.6%、52.8%、50.6%、48%及42.2%。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-CT,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段且连接、构建正确,为利用pCEP4-CT调控机体骨钙代谢、防治蛋鸡骨质疏松症的研究和应用奠定了基础。     

传染性支气管炎N基因克隆及在大肠杆菌中的可溶性表达

核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据GenBank报道的IBV的M41株的N基因序列设计一对引物,从提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技术扩增获得了约1.23kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD18-T,经测定核苷酸序列证实N基因扩增正确,表明已成功构建pMD18-T-N。再将pMD18-T-N用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌Rossetta中,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白,Western-blotting检测表明N蛋白可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应,表明N蛋白有一定的生物活性,可为用于生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础。     

奶牛载脂蛋白B100基因克隆及原核表达

本研究根据GenBank已收录奶牛ApoB100基因序列,设计特异性引物获得目的基因。经pGM-T载体克隆,对重组质粒进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定并测序,序列同源性达100%;将目的基因连接到pET-28a表达载体中,提取质粒,转化到Rosetta(DE3)中,筛选的阳性克隆经IPTG诱导。SDS-PAGE初步分析表明,成功获得分子质量为35 ku的蛋白质;Western blotting结果呈阳性,表明通过本试验成功获得了目的蛋白。     

鸡传染性支气管炎X毒株S1基因的克隆与真核表达

根据GenBank中报道的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因序列，设计了1对引物，克隆了IBV强毒株X的S1基因，基因大小为1．62kb。将其导入真核表达载体系统pIRES1neo中，表达蛋白为61000。     

猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆、表达

利用已分离的菌株030224HB，根据NCBI上的序列(U52208)设计了一对引物，用PCR方法扩增了猪源多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白基因(ompH)，扩增的片段大小为1114bp(ORF为960bp)，并克隆到载体pMD18-T(T-Vector)，测序表明该基因相当保守。用pET-28b构建了原核表达载体pET28b-ompH，转化BL21并诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为35ku，与报道大小相近。Western-blot结果表明表达的蛋白质具有生物学活性，然后用所表达的蛋白做了ELISA检测方法的初步探讨。     

羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达

为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。     

巴马香猪CIDEa基因克隆及组织表达分析

本试验旨在对巴马香猪CIDEa基因序列进行克隆,预测其蛋白结构和功能,并进行组织表达分析。根据NCBI已经公布猪的CIDEa基因序列(登录号:NM_001112696.2),利用Oligo 7.0软件设计引物,采用RT-PCR法扩增并克隆巴马香猪CIDEa基因序列,利用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码蛋白的疏水性、理化性质、跨膜结构域、二级结构、三级结构及互作蛋白,并采用实时荧光定量PCR方法检测CIDEa基因在巴马香猪皮下脂肪、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、背最长肌及心脏的表达规律。结果显示,试验成功获得巴马香猪CIDEa基因CDS区序列,全长660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank中猪、牛、马、犬、人、猕猴和家鼠的核苷酸相似性分别为99.4%、84.7%、81.5%、80.9%、79.7%、78.9%和76.1%。与GenBank中野猪CIDEa基因核苷酸序列比对发现,发生4处碱基突变,其中A609G和T627C位点为同义突变,C173T(Pro→Leu)和C631T(Arg→Cys)位点为错义突变。巴马香猪CIDEa蛋白分子质量为24 483.57 u,等电点为9.48,不稳定指数为52.86,属于不稳定蛋白;该蛋白中亮氨酸(Leu)含量最高(13.2%),色氨酸(Trp)含量最低(0.5%)。巴马香猪CIDEa蛋白为膜外亲水性蛋白,包含1个超家族结构域(CIDE-N)。二级结构预测发现,巴马香猪CIDEa蛋白包含α-螺旋(45.66%)、β-转角(5.94%)、延伸链(14.61%)和无规则卷曲(33.79%),三级结构预测结果与二级结构一致。蛋白互作分析结果表明,巴马香猪CIDEa蛋白与PPARG、PPARGC-1、COX8H、PRDM16、DIO2、TMEM26、ELOVL3、COX7A1、CIDEC、DFFB蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,CIDEa基因在巴马香猪皮下脂肪中表达量最高,且显著高于其他组织(P<0.05),心脏中表达量最低。研究结果为进一步探讨CIDEa基因对巴马香猪脂肪沉积的调控机制提供理论依据。     

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1（Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1）的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息,本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因,应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系,并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示,ROCK1基因有2个转录本,包含4 065 bp的开放阅读框（ORF）,编码1 354个氨基酸;猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%,相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%,该蛋白在不同物种间高度保守;ROCK1基因的组织分布较广泛,不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化;胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪（P < 0.01）,出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异（P > 0.05）。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。