猪囊等孢球虫孢子化与未孢子化卵囊的差异表达蛋白质组学分析

通过比较猪囊等孢球虫孢子化卵囊与未孢子化卵囊的差异表达蛋白质,以期从蛋白质组学角度研究其发育机制,并为此类球虫的发育机制及该病的免疫预防或化学防治找到新的“关键”分子奠定基础。首先建立哺乳仔猪的猪囊等孢球虫感染模型,然后运用iTRAQ技术,结合LC-MS/MS分析差异表达蛋白质,并采用荧光定量PCR验证iTRAQ数据。结果共鉴定出174个蛋白,差异表达蛋白40个,其中38个蛋白上调表达,2个蛋白下调表达,差异蛋白主要涉及代谢、抗生素的生物合成、次生代谢产物的生物合成和糖酵解/糖异生过程等通路。研究结果为阐明猪囊等孢球虫孢子化发育机制以及发现新的生物标志物提供参考。     

低浓度阿奇霉素对猪链球菌2型蛋白表达、荚膜多糖与药物敏感性的影响

本研究通过探索低浓度阿奇霉素对猪链球菌2型蛋白表达、荚膜多糖与药物敏感性的影响，为进一步研究环境中低浓度抗生素对微生物的影响奠定基础。用低浓度阿奇霉素处理猪链球菌2型，利用蛋白质组学iTRAQ技术，筛选关键差异表达蛋白。同时测定猪链球菌2型的荚膜多糖含量和药物敏感性。结果显示，共鉴定到差异表达蛋白174个，占总鉴定蛋白的11.6%,多数差异表达蛋白参与催化和代谢过程，属于膜蛋白，其中，3个荚膜多糖蛋白、9个ABC转运蛋白、1个50 S核糖体蛋白、1个核糖体RNA甲基转移酶、1个DNA回旋酶上调表达；8个荚膜多糖蛋白、4个50S核糖体蛋白、4个30S核糖体蛋白、1个核糖体RNA甲基转移酶、1个DNA聚合酶IV下调表达。用低浓度阿奇霉素处理猪链球菌2型，发现其对多种抗生素的敏感性降低，存活下来的菌株，恢复正常培养后，药物敏感性恢复。用低浓度阿奇霉素处理猪链球菌2型，荚膜多糖含量也未发生大幅度变化。猪链球菌2型通过改变自身蛋白质组的表达量，以适应低浓度阿奇霉素的选择压力。与低浓度阿奇霉素共存时，猪链球菌2型开启外排泵系统，会增加细菌产生多重耐药的风险。     

Characterization of proteins in sporulated and unsporulated Eimeria maxima oocysts

Proteins in sporulated and unsporulated oocysts of Eimeria maxima were characterized, using monoclonal antibodies (MAB), ELISA, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and protein (western) immunoblotting techniques. Three MAB (EM1, EM2, and EM4) were produced against proteins of sporulated oocysts. The ELISA results indicated that EM1 was reactive with sporulated oocyst proteins, EM2 was reactive with sporulated and unsporulated oocyst proteins, and EM4 was reactive with unsporulated oocysts and proteins. Separation of proteins in E maxima sporulated and unsporulated oocysts by SDS-PAGE indicated that sporulated oocysts had proteins of approximately 200 kilodaltons (kD) and distinct protein bands at 21.5 and 45 kD. Using SDS-PAGE, unsporulated oocysts had less-distinct high molecular weight protein bands (greater than 200 kD), compared with sporulated oocysts, and a distinct protein band at 31 kD. Use of all 3 MAB yielded negative results in western blot analysis of fractions obtained by SDS-PAGE.     

球虫消毒剂的筛选及氨水对艾美耳球虫卵囊抑杀条件的优化

为了筛选有效的球虫消毒剂,本研究将柔嫩艾美耳球虫卵囊分别与16种常用消毒剂和1种高效抗球虫药物溶液（250 mg/L妥曲珠利溶液）混合作用2 h然后在2.5%重铬酸钾溶液中孢子化培养,或混合作用4 h后接种14日龄雏鸡,根据卵囊孢子化率、孢子化抑制率、每克粪便卵囊数量（oocysts per gram of feces,OPG）、病变计分和血便情况评价消毒剂和抗球虫药物抑杀球虫卵囊效果。结果显示,8%氨水对未孢子化卵囊和孢子化卵囊均表现为100%的抑杀效果;250 mg/L妥曲珠利、3%甲醛、4%苯酚、0.5%过氧乙酸、5% NaOH+10% NaCl和5% NaOH对球虫卵囊活性具有一定的抑制作用,孢子化抑制率超过10%,但是对孢子化卵囊抑杀作用不明显;而剩余10种常用消毒剂对球虫卵囊没有明显的抑杀作用。氨水抑杀球虫卵囊条件优化的试验结果显示,1%~8%氨水与未孢子化卵囊作用1 h以上,均可100%抑杀球虫卵囊活性。粪便干扰试验结果显示,粪便不影响2%和4%氨水对球虫卵囊的抑杀效果。本研究结果说明常用消毒剂和抗球虫药物不能有效杀灭球虫卵囊的活性,而氨水是一种高效球虫消毒剂。本研究结果可为开发新型高效球虫消毒剂和球虫病控制提供参考。     

VPS28通过泛素化信号通路调控奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白的合成

旨在分析VPS28基因调控乳蛋白合成的分子机制，为奶牛泌乳性状的分子育种奠定理论基础。本研究首先利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术敲降奶牛原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）中VPS28基因的表达水平，检测与乳蛋白合成、泛素化-溶酶体和泛素化-蛋白酶体通路相关的11个基因、泛素蛋白的表达水平及蛋白酶体活性；然后抑制BMECs中蛋白酶体和溶酶体的活性，检测酪蛋白相关基因、核糖体蛋白的表达水平；最后利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）比较蛋白质组学分析敲降前后BMECs的差异表达蛋白。结果表明，敲降VPS28基因后，CSN1S1、CSN2、CSN3、RPS8、UBC、PSMC3、PSMC5基因均显著上调，PSMD12显著下调；抑制蛋白酶体后，CSN1S1、CSN2、CSN3显著上调，RPL13显著下调；抑制溶酶体活性后酪蛋白相关基因表达不显著；iTRAQ结果共筛选出129个差异表达蛋白，下调蛋白主要富集在核糖体、溶酶体、剪切体等相关通路，上调蛋白主要富集在内质网的蛋白质加工、加压素调控的水重吸收过程、RNA转运等通路中。研究表明，VPS28基因可通过泛素化信号通路影响BMECs中乳蛋白的合成。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG）基因的分离及鉴定

利用本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子化卵囊和未孢子化卵囊差异表达ESTs序列,选取编号为BW4-C03的孢子化卵囊,采用RACE技术,获得该基因全长序列。经BLAST分析,该序列与柔嫩艾美耳球虫表面抗原有72%以上的同源性,命名为EtSAG。利用荧光定量PCR（Real-time PCR）检测发现该基因在孢子化卵囊的转录拷贝数最高,且随着孢子化时间的延长,转录拷贝数逐渐增加。采用原核表达载体pET-28C表达该基因,得到的融合蛋白大小约为36 kDa,符合预期大小。经Western blot分析,该重组蛋白可被兔抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫Etron2基因在不同发育阶段转录水平差异的分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同发育时期Etron2基因的转录水平差异,选取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子,分别提取总RNA,反转录为cDNA;选择Etactin作为参照基因,Etron2为目的基因,设计实时荧光定量PCR的引物,分析在E.tenella生活史中不同发育阶段Etron2转录水平的差异。结果显示Etron2在未孢子化卵囊中转录水平最高,然后分别是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子。在柔嫩艾美耳球虫发育过程中,Etron2基因可能在未孢子化卵囊阶段被转录储备,随着宿主细胞的刺激,得以大量表达,在入侵过程中发挥作用。     

鸡巨型艾美耳球虫单卵囊分离及雏鸡扩增试验

采用饱和食盐水漂浮法收集就诊病死球虫阳性鸡小肠中段内容物中的球虫卵囊,恒温培养至孢子化后,用2%琼脂薄板进行球虫单卵囊分离,分别感染7只5日龄雏鸡,对据形态学鉴定为巨型艾美耳球虫的分离株进行2代单卵囊分离和雏鸡感染,取其后代以每只1.0×10⁴个卵囊感染10只10日龄雏鸡进行卵囊扩增,获得大量纯种巨型艾美耳球虫卵囊。结果表明,刀片切割琼脂薄板单卵囊分离法操作简便,单卵囊感染成功率较高,准确率达100%,适用于纯种卵囊的分离与扩增。     

毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的原核表达与定位分析

旨在探析毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的功能。提取毒害艾美耳球虫扬州株配子体总RNA,应用RT-PCR获取EnOXIO1编码基因,构建原核表达载体pET-28a(+)-EnOXIO1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),体外诱导表达,对重组蛋白进行抗原性分析,应用制备的多抗进行激光共聚焦免疫荧光定位。结果显示,获得的EnOXIO1基因全长为2 535 bp,体外重组表达的蛋白大小约100 ku,主要以包涵体的形式存在,表达量约为0.5 mg·mL^-1。Western blot分析结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体识别,同时能被制备的鼠多抗以及毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明该重组蛋白具有较好的反应原性和交叉反应原性。激光共聚焦免疫荧光定位结果显示,EnOXIO1基因表达产物主要存在于配子体内的成壁体上,参与了卵囊壁的形成。本研究成功克隆和表达了毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白,并将其定位于配子体和卵囊壁上,为进一步解析EnOXIO1蛋白参与卵囊壁形成的分子机制奠定基础,为研制新型免疫阻断型球虫亚单位疫苗提供重要靶抗原。     

弓形虫卵囊感染小鼠的急性期与慢性期的脑组织蛋白质组变化

弓形虫是一种呈世界性分布的机会性致病原虫,可引起致命性脑炎.人弓形虫病急性感染往往与弓形虫卵囊污染密切相关.探究弓形虫卵囊感染对宿主的致病机制和防控弓形虫病具有重要意义.因此,本研究利用iTRAQ技术,结合2D-LC-MS/MS分析弓形虫PRU虫株卵囊急、慢性感染小鼠后,其脑组织蛋白质的差异表达情况.结果 表明,在急性...     

Column chromatographic characterization of cytoplasmic proteins in Eimeria maxima oocysts from chickens

Cytoplasmic proteins from unsporulated and sporulated Eimeria maxima oocysts were analyzed by gel-filtration column chromatography. Unsporulated oocysts were characterized as having 3 major cytoplasmic proteins and sporulated oocysts as having 5 major cytoplasmic proteins. Molecular weights ranged from 5 x 10(3) to 1.4 x 10(6). Larger molecular weight proteins were detected in sporulated and unsporulated oocysts, but were associated more with sporocysts of sporulated oocysts.     

鸡艾美耳球虫单卵囊分离技术的建立

以玻璃纸做材料,用毛细吸管分离单卵囊,通过显微镜"重复"鉴定法,对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)进行分离.单卵囊感染20只鸡,在感染后5 d～15 d,用饱和盐水漂浮集卵法进行检测.结果显示,有15只鸡粪便中检出卵囊,经鉴定均为所要分离的虫种(E. tenella),感染成功率为75%,准确率达100%.另外,应用改进后的玻璃纸单卵囊分离技术还成功分离到毒害、巨型、堆型、布氏、和缓和早熟艾美耳球虫的单一虫种.结果表明,改进后的单卵囊分离技术简单易行,感染方便,成功率和准确率都较高,而且所用材料易于获得,消毒方便.     

斯氏艾美耳球虫重组表面抗原SAG13和SAG14对兔的免疫保护效果初步观察

本研究旨在观察斯氏艾美耳球虫裂殖生殖阶段特异性表面抗原Es-SAG13和Es-SAG14的原核表达产物对兔的免疫保护效果.利用相对荧光定量PCR分析Es-SAGs在未孢子化卵囊时期、孢子化卵囊时期、裂殖生殖时期和配子生殖时期的转录水平,并对裂殖生殖阶段特异性表达的Es-SAG进行原核表达;然后将40只45日龄无球虫幼兔...     

猪链球菌自溶素的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】 建立快速、准确检测猪链球菌自溶素（atl）抗体的间接ELISA方法。【方法】 根据GenBank登录的猪链球菌atl基因序列设计1对引物,采用PCR方法从猪源链球菌中获得atl基因序列;构建pET-32a-atl和pGEX-4T-1-atl重组质粒,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达;以表达纯化后的atl-His融合蛋白为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;以兔多克隆抗体为一抗,用Western blotting方法检测atl-GST融合蛋白的反应原性;以纯化后的atl-GST融合蛋白为包被抗原,猪链球菌感染阳性血清作为标准血清,建立猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA检测方法。利用本试验建立的ELISA方法与商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒同时对184份血清样品进行检测并用本试验建立的方法进行临床样品检测。【结果】 从猪链球菌中成功扩增出atl基因;构建的重组质粒,经诱导表达和纯化,获得大小为40 ku的atl-His和48 ku的atl-GST融合蛋白;经Western blotting验证,兔抗atl-His抗血清与atl-GST融合蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA结果显示,该检测方法的阴阳临界值为0.318,阳性血清稀释至1：1 280检测仍为阳性;批内批间变异系数均<10%,表明该方法具有良好的重复性及敏感性。本试验所建立的ELISA方法检测出96份阳性样品,商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测出66份阳性样品,符合率为71.7%。应用建立的方法检测458份不同饲养阶段的猪血清样品,其中检出277份阳性样品,阳性率为60.4%。【结论】 本试验成功建立了检测猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA方法并进行了初步应用,为猪链球菌病血清流行病学调查奠定了基础。     

Occurrence of fatal canine Angiostrongylus vasorum infection in Italy

A total of 469 fecal samples were collected from American minks (Mustela vison) on a farm in Hebei Province in China and examined for Cryptosporidium by Sheather's sugar flotation technique and 8 Cryptosporidim isolates were obtained. The partial 18S rRNA, 70 kDa heat shock protein (HSP70), Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP) and actin genes of six isolates were sequenced. Sequence data were analyzed together with known Cryptosporidium spp. and genotypes. Results of this multi-locus genetic characterization indicated that the six Cryptosporidium isolates in this study shared the same sequences of the genes studied and were different from known Cryptosporidium species and genotypes. The closest relative was Cryptosporidium ferret genotype with 7, 22, 2 and 2 nucleotide differences in the 18S rRNA, HSP70, COWP and actin genes, respectively. The homology to ferret genotype at the 18S rRNA locus was 99.1%, which is comparable to that between C. parvum and C. hominis (99.2%), or between C. muris and C. andersoni (99.4%). Therefore, the Cryptosporidium in minks in this study is considered a new genotype, the Cryptosporidium mink genotype.     

影响鸡球虫单卵囊分离纯化的因素分析

单卵囊分离技术是获得品种单一、基因型纯净的卵囊,以便更有效的鉴别球虫种类和建立球虫纯种体系的重要手段.论文主要从雏鸡日龄、卵囊侵袭力、分离方法和材料的选择三个方面来分析其对鸡球虫单卵囊分离纯化的影响,从而为单卵囊分离技术的改进提供指导,进一步为球虫的各项研究提供基础.     

C型产气荚膜梭菌实验感染仔猪肠道circRNA的表达特征

circRNAs在病原菌感染宿主的肠道疾病发展中具有重要的调控作用。C型产气荚膜梭菌（C.perfringens type C）是引起仔猪腹泻及相关肠道炎症的主要细菌之一,对产业造成了严重的经济损失。然而,目前有关circRNAs如何调控仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻的全面且系统的研究未见报道。本研究通过RNA高通量测序研究分析了C型产气荚膜梭菌感染的7日龄仔猪回肠组织circRNAs的表达谱,筛选差异表达circRNAs,并进行差异表达基因GO和KEGG功能富集分析,利用miRanda等软件预测circRNA的microRNA靶点,构建circRNA-miRNA-mRNA的互作网络,并进行qPCR验证。结果显示,在C型产气荚膜梭菌感染的处理组（TI组）和对照组（CI组）中共鉴定出3 162个circRNAs,其中差异表达circRNAs有694个,上调表达circRNAs有404个,下调表达circRNAs有290个。功能富集分析结果表明,差异表达circRNAs的亲本基因主要富集在细胞周期、TGF-β信号通路、赖氨酸降解、Wnt信号通路、T细胞受体信号通路、MAPK信号通路等,调节仔猪对产气荚膜梭菌感染的抗性反应。此外,本研究构建了与C型产气荚膜梭菌感染致仔猪腹泻相关的circRNA-miRNA-mRNA互作网络,发现8 circRNAs-5 miRNAs-12 mRNAs组成的ceRNA网络与产气荚膜梭菌感染性疾病密切相关。本试验可为深入研究circRNA调控仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻疾病及猪抗腹泻病品系培育提供参考。     

猪链球菌14型的分离鉴定及生物学特性研究

为了检测确定2019年5月河南某规模化猪场一栋保育仔猪发病猪群的病原,本研究从送检的发病猪关节液中分离获得1株细菌。通过细菌纯化培养、革兰氏染色、形态学观察及猪链球菌gdh基因PCR扩增,确定该分离菌株为猪链球菌。用猪链球菌分型引物对该菌株进行PCR扩增分型鉴定及软件比对分析,结果表明该分离菌株为猪链球菌14型,与猪链球菌JS14株（GenBank登录号：CP002465.1）同源性为100%。毒力基因检测结果表明,该菌株的同时携带有epf、mrp、sly、fbps、orf2毒力基因,属于高致病性菌株。小鼠致病性试验结果也证明该菌株是一株高致病性猪链球菌。药物敏感性试验结果显示,该菌株对β内酰胺类和喹诺酮类药物敏感,对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和磺胺类高度耐药,表现出多重耐药现象。对该菌株进行5大类24种耐药基因检测,该菌株同时携带有bla_TEM、aadA1、strA、strB、aacC2、aphA1、tet（B）、gyrA、parC、sul2耐药基因。该研究为后续进一步开展猪链球菌14型流行特点和致病机制研究奠定了基础,为猪链球菌14型临床防控提供了理论依据,同时具有重要的公共卫生意义。     

猪β防御素-2对猪链球菌感染小鼠的治疗效果评价

防御素是一种广泛分布于动植物中的阳离子小肽,是哺乳动物先天性免疫防御系统的重要成分,具有广谱抗菌、抗病毒和抗真菌活性。猪β防御素-2（porcine β-defensin-2,PBD-2）是猪表达的天然防御素之一,在体外具有良好的抗菌活性。本研究旨在评价PBD-2在动物体内对重要的人兽共患病原菌猪链球菌感染的治疗效果,为评估PBD-2成为治疗性药物的潜在价值提供依据。首先,在体外检测了PBD-2对猪链球菌临床分离菌株SC-19的杀菌活性,并且在鼠源巨噬细胞（RAW264.7）上检测了PBD-2的细胞毒性。随后,选取4~6周龄,体重在18~22 g的C57雌鼠,检测了PBD-2处理组和PBS对照组小鼠（n≥6）感染猪链球菌SC-19后的存活率、组织载菌量、炎性细胞因子水平和病理变化。结果表明,PBD-2（25~200 μg·mL^-1）可显著地抑制猪链球菌SC-19生长（P<0.05）,且抑制作用随浓度升高而增强,同时,对RAW细胞无显著的毒性作用（P>0.05）。在体内,PBD-2处理能有效降低小鼠感染猪链球菌SC-19后的死亡率,并且显著降低小鼠感染细菌后的脑、肺、脾组织和血液中的细菌载量,以及血清中炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的水平（P<0.05）。同时,PBD-2治疗也显著降低了小鼠感染细菌后肺和脾组织的病理变化程度（P<0.05）。这些结果说明,PBD-2在体外具有良好的抗猪链球菌的活性,无显著细胞毒性,同时,在小鼠体内对猪链球菌感染具有治疗效果,提示,PBD-2具有进一步开发为治疗性药物的潜力。     

Evaluation of Therapeutic Effect of Porcine β-defensin-2 on Streptococcus suis Infection

Defensin is a small cationic peptide widely distributed in animals and plants. It is an important component of the innate immune defense system of mammals. It has a broad spectrum of antibacterial, antiviral and antifungal activities. Porcine β-defensin-2 (PBD-2) is one of the natural defensins expressed in pigs and has good antibacterial activity in vitro. The purpose of this study is to evaluate the therapeutic effect of PBD-2 in the treatment of Streptococcus suis infection in animals and to provide more insights for evaluating the value of PBD-2 as a therapeutic drug. Firstly, the bactericidal activity of PBD-2 against S. suis clinical isolate SC-19 was measured in vitro, and the cytotoxicity of PBD-2 was tested on mouse-derived macrophages (RAW264.7). Subsequently, C57 female mice aged 4-6 weeks and weighing between 18-22 g infected with S. suis SC-19 were treated with PBD-2 or PBS (n ≥ 6). The survival rate of mice, and the bacteria loads, inflammatory cytokine levels, and pathological changes of tissues were determined. The results showed that PBD-2 (25-200 μg·mL^-1) could significantly inhibit the growth of S. suis SC-19 in a concentration-dependent manner (P<0.05). At the same time, PBD-2 had no significant toxic effect on RAW cells (P>0.05). The in vivo study revealed that PBD-2 treatment could effectively reduce the mortality of mice infected with S. suis SC-19. At the same time, PBD-2 treatment significantly reduced bacteria loads in brain, lung, spleen and blood of mice, and decreased the levels of inflammatory cytokines IL-6, IL-12 and TNF-α in mouse sera (P<0.05). At the same time, PBD-2 treatment also significantly alleviated the degree of pathological damages in lung and spleen tissues of mice infected with bacteria (P<0.05). These results indicate that PBD-2 confers great resilience to S. suis in vitro without significant cytotoxicity, while it also exhibits a therapeutic effect on S. suis infection in mice, suggesting that the use of PBD-2 as a therapeutic drug and substitutes for antibiotics is of an excellent prospect.