用裂殖体和卵囊抗原检测鸡球虫血清抗体

将柔嫩艾美球虫孢子化卵囊和第二代裂殖体制成可溶性抗原,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测实验感染性柔嫩艾美球虫肉用鸡和SPF单冠白来航蛋鸡的血清抗体。肉鸡于15日龄接种卵囊,接种后19天,ELISA值迅速增加,接种后29和32天,抗裂殖体和卵囊抗原ELISA值均达最高值。抗裂殖体抗原ELISA值明显高于抗卵囊抗原ELISA值。SPF蛋鸡于15日龄接种孢子化卵囊,接种后7天,ELISA值迅速增加,抗两种抗原ELISA值无显著差异。通常肉用鸡ELISA值趋向高于SPF蛋鸡,特别是抗裂殖体抗原ELISA位。肉用鸡于1日龄和15日龄接种卵囊,ELISA值迅速增加,在接种后11天和第二次接种后20天,抗裂殖体和卵囊抗原ELISA值达最高水平。此后,抗裂殖体抗原ELISA值下降。抗裂殖体抗原ELISA值显著高于抗卵囊抗原ELISA值。SPF蛋鸡两次接种。第二次接种后11天,ELISA值达最高水平。此后抗两种抗原ELISA值均降低。抗两种抗原的血清学反应相似。肉鸡抗裂殖体抗原ELISA值显著高于SPF蛋鸡。母源抗体在肉鸡相对较高,以后随出生年龄增长逐渐降低,在10日龄趋于消失。     

柔嫩艾美耳球虫的抗原分析

本文采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印渍技术，用抗柔嫩艾美耳球虫抗体分析了第二代型殖子、子孢子和未孢子化卵囊的蛋白质。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳银染表明第二代裂殖子主要蛋白质为：１７．６ＫＤ，２９．９ＫＤ，３８．９ＫＤ和５３．７ＫＤ，但用抗Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗体免疫印渍法检测出的主要抗原为：７８．０ＫＤ，８３．２ＫＤ和９５．５ＫＤ，这说明并不是含量高的蛋白质就是产生抗体的抗原；子孢子蛋白质含     

柔嫩艾美尔球虫和巨形艾美尔球虫混合感染致病性研究

材料和方法１．试验动物ＡＡ肉鸡，购自江苏省家禽研究所，出壳后运回实验室饲养在杀灭卵囊的笼具中至１５日龄，经数次粪检未见卵囊后供试验。２．球虫卵囊为本教研室分离鉴定的纯种柔嫩艾美尔球虫和巨形艾美尔球虫孢子化卵囊，４℃保存。３．试验分组挑选体况相近的１５日龄ＡＡ肉鸡５０羽，分成５组。第１组为不感染对照组；第２组为单种球虫感染组，每羽经口接种柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊１万个；第３、４和５组为混合感染组，每羽分别同时感染柔嫩艾美尔球虫和巨形艾美尔球虫孢子化卵囊：０．５＋５万、１＋１０万和２＋２０万个。４．…     

家兔黄艾美耳球虫血清抗体ELISA检测法的建立

应用制备的孢子化卵囊可溶性抗原作了包被抗原建立了兔球虫血清抗体的ＥＬＩＳＡ检测法。其最适条件为：抗原包被浓度，２００μｇ／ｍＬ；包被温度，３７℃（２ｈ）；血清反应时间，１．５ｈ；酶标抗体标准工作浓度，１：１０００；反应时间，１ｈ待检血清稀释度，１：１００：ＥＬＩＳＡ试验的规定吸收值为０．０６，孢子化卵囊可溶性抗原比非孢子化卵囊可溶性抗源更适于作为ＥＬＩＳＡ包被抗原。     

ELISA检测三种家鸭试验性感染潜鸭艾美耳球虫的血清抗体

将潜鸭艾美耳球虫孢子化卵爱清洁、纯化，捣碎滤过制成可溶性抗原，用于ＥＬＩＳＡ检测番鸭、北京鸭和二者杂交种骡鸭试验性感染潜鸭艾美耳球虫后血清中抗体的变化。试验鸭于１１日龄每只口服接种孢子化卵囊７．５×１０４个，接种感染后第３天血清抗体的ＯＤ值开始上升，番鸭和骡鸭感染后第１０天血清抗体达峰值，而北京鸭的峰值出现较晚，在感染后第１７天。番鸭和骡鸭在试验期间血清抗体ＯＤ值有两个峰值：第２峰值番鸭出现在感染后第１７天，骡鸭在感染后第２０天。３种鸭血清ＩｇＧ的变化曲线与血清Ｉｇｓ的相近似，表明在家鸭感染球虫后血清ＩｇＧ在血清抗体Ｉｇｓ中占主要地位。同时各组的不感染健康鸭血清免疫球蛋白随日龄增大显缓慢增长，但明显低于接种感染鸭。     

抗球虫剂——常山酮

常山酮(商品名 Stenorol)是法国 R-oussel-Uclaf 生产的抗球虫剂,对柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫等均有效,该药对卵囊内释出的子孢子,对第一代和第二代裂殖体有明显的抑制作用,并能消除卵囊的排出。     

白头翁不同提取物及复方抗鸡柔嫩艾美耳球虫研究

以存活率、相对增重率、盲肠病变记分、卵囊值和抗球虫指数为判定指标,考察白头翁不同提取物及复方对鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊致病性的影响(体外试验)和抗鸡柔嫩艾美耳球虫感染效果(体内试验)。体内、体外试验结果均表明,白头翁不同提取物及复方均能提高相对增重率,降低盲肠病变计分和卵囊值。抗球虫指数(ACI)检测表明,白头翁不同提取物及复方对球虫孢子化卵囊有微弱的抑杀效果,对鸡柔嫩艾美耳球虫感染预防效果较差,不宜作为鸡柔嫩艾美耳球虫病的预防和治疗药物。     

ELISA检测DLV虫苗免疫鸡抗体消长规律的研究

将柔嫩、毒害、巨型艾美耳球虫的孢子化卵囊制成可溶性抗原，用酶联免疫吸附试验检测鸡球虫双重致弱多凤苗虫苗、为柔嫩、毒害、巨型艾美耳球虫三价苗免疫鸡血清抗球虫抗体的消长规律。     

净球散对鸡球虫病的疗效试验

以１５日龄肉仔鸡为试验动物,研究了纯中药制剂净球散对鸡柔嫩艾美耳球虫病的疗效以及对卵囊孢子化影响。结果表明：在饲养中添加１％的净球散具有良好的抗球虫效果,抗球虫指数（ＡＣＩ）达到１８７。用５０％、１００％的净球散煎剂浸泡７ｄ后,再用２．５％的重铬酸钾培养３ｄ,鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率分别为６５．４２％、６６．２３％,抑制作用明显,说明净球散是一种较理想的抗球虫中药制剂。     

柔嫩艾美耳球虫Etron2基因在不同发育阶段转录水平差异的分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同发育时期Etron2基因的转录水平差异,选取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子,分别提取总RNA,反转录为cDNA;选择Etactin作为参照基因,Etron2为目的基因,设计实时荧光定量PCR的引物,分析在E.tenella生活史中不同发育阶段Etron2转录水平的差异。结果显示Etron2在未孢子化卵囊中转录水平最高,然后分别是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子。在柔嫩艾美耳球虫发育过程中,Etron2基因可能在未孢子化卵囊阶段被转录储备,随着宿主细胞的刺激,得以大量表达,在入侵过程中发挥作用。     

鸡柔嫩艾美球虫DNA疫苗pcDNA4．0（C）-pEtK2-IL-2对其他球虫的交叉保护力

将柔嫩艾美球虫DNA疫苗pcDNA4．0（c）-pEtK2-IL-2以50μg分别对14日龄和21日龄雏鸡进行胸部肌肉注射免疫，28日龄对各未免疫组与免疫组鸡分别口服接种柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和毒害艾美球虫孢子化卵囊，36日龄剖杀，分析比较免疫保护效果。结果显示，柔嫩艾美球虫攻毒免疫试验组与柔嫩艾美球虫攻毒未免疫对照组比较，增重、盲肠病变记分、OPG值差异显著（P〈0．05），免疫保护效果明显，抗球虫指数（ACI）达186．50；而巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和毒害艾关球虫攻毒免疫试验组的ACI分别为147．85、142．71和153．82，增重、盲肠病变记分、OPG值和ACI与相应的攻毒未免疫对照组比较，均有不同程度改善，免疫保护效果不明显。表明，该DNA疫苗对柔嫩艾美球虫的攻击具有完全免疫保护作用，而对巨型艾美球虫、堆形艾关球虫、毒害艾美球虫的攻击具有部分交叉保护力。     

球抗预防鸡柔嫩艾美耳球虫病效果的观察

采用接种孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊的方法,复制鸡球虫病,观察并计算球抗对柔嫩艾美耳球虫病鸡的存活率、相对增重率、血便记分、盲肠病变记分和卵囊值的影响,并求出球抗的抗球虫指数.结果发现球抗能提高球虫病鸡的存活率和相对增重率,减少血便记分和盲肠内容物卵囊数,减轻盲肠病变.表明球抗对鸡柔嫩艾美耳球虫病有一定的预防作用.     

柔嫩艾美耳球虫含HD结构域蛋白特性和功能初步研究

鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenela)杂交虫株(F2)的培育

将山东株(S)与吉林株(J)柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊通过单卵囊技术接种雏鸡,收获卵囊后提取基因组DNA,利用RAPD技术分析DNA,筛选出杂交株(F1),再用该F1代与黑龙江株(H)柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊单卵囊接种雏鸡,相同方法鉴别筛选,确定了1株为山东株、吉林株和黑龙江株三个地理株的杂交(F2)卵囊。该结果为深入研究球虫的免疫机制奠定了基拙。     

在鸡胚中培养柔嫩艾美耳球虫的最适条件

观察了在不同条件下柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)在鸡胚中的发育。用10~3子孢子经尿囊腔、蛋黄囊或绒毛尿囊膜(CAM)接种10日龄鸡胚,置41℃培养。仅从接种鸡胚的尿囊腔中发现了卵囊,接种后48小时在那里发现了第一代裂殖体,72小时发现了第二代裂殖体,144小时发现了配子和卵囊。许多卵囊在CAM和尿酸盐沉淀中,少数在尿囊液中。接种后7和8天观察鸡胚,卵囊的数量相似,这两天鸡胚中孢子发生率无明显差异。在接种的8和12日龄的鸡胚中,死亡率差异不显著,而在8日龄接种鸡胚得到的卵囊数最低。死亡率随接种量(在100和100,000之间)的增加而增加,卵囊数的增加与剂量(从63到10,000)的对数成比例。从试验结果可以明显看出,将1×10~3个子孢子经尿囊腔接种于9到12日龄鸡胚,然后在41℃孵育7—8天,可从CAM和尿酸盐中有效地获得卵囊。     

益生菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡保护效果研究

接种柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)孢子化卵囊和益生菌,以血便记分、存活率、体增重和抗球虫指数为指标,探讨益生菌的抗球虫活性。在接种第7天后检测结果显示,益生菌抗球虫指数为137,能降低球虫感染鸡的血便记分,减轻鸡盲肠组织病理学结构的损伤,提高球虫感染鸡体增重和存活率,提示益生菌可以辅助应用于临床球虫病的防治。     

不同品种地方鸡对柔嫩艾美球虫的易感性分析

按每只鸡12×10~4个孢子化卵囊的剂量,分别感染20日龄大骨鸡、鹿苑鸡、油鸡和固始鸡,以存活率、相对增重率、血便扣分、病变扣分、卵囊扣分和抗球虫指数为评价指标,分析比较4个地方品种鸡对柔嫩艾美球虫的易感性。试验重复1次。结果显示,4个地方品种鸡对柔嫩艾美球虫的易感性不同。固始鸡对柔嫩艾美球虫易感性最高,表现为感染后的死亡率最高,病变扣分最多,抗球虫指数也最低。油鸡对柔嫩艾美球虫的易感性最低,表现为感染后的死亡率为零,病变扣分和血粪扣分最少,每鸡平均排卵囊数最少,抗球虫指数最高。大骨鸡和鹿苑鸡对柔嫩艾美球虫的易感性相近,位于固始鸡与油鸡之间。     

堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫卵囊最短孢子发育时间的测定

将收集到的新排出的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)与柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)卵囊于29℃静态系统中孢化。以30min为间隔，对卵囊孢子发育的4个阶段在显微镜下进行观察。以1h为间隔，用发育中的卵囊连续接种无球虫鸡，以确定最短孢子发育时间(MST)。对影响孢子发育的外部因素进行了初步探讨。用堆型艾美耳球虫比较不同卵囊浓度，不同悬液深度在卵囊孢化过程中第20h时子孢子形成的卵囊百分率。E.acervulina与E.tenella的MST分别为11b与18b。卵囊浓度和悬液深度与孢子发育时间呈明显反比关系。     

应用间接酶联免疫吸附试验检测鸡抗球虫早熟株三价苗抗体

将无球虫雏鸡随机分为２组,在７日龄和１４日龄分别经口接种鸡球虫早熟株三价苗３０００个／只卵囊和５０００个／只卵囊,用间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测血清抗球虫抗体的变化情况。结果。在首免后的第３、５和７ｄ用间接ＥＬＩＳＡ检测ＯＤ值为０．３３１、０．３４２和０．４１８,上升缓慢;二免后体水平稍有下降（ＯＤ值０．３８３）,随后迅速上升（ＯＤ值０．４７２）,于二兔后第１２ｄ达最高峰（ＯＤ值０．８５     

柔嫩艾美耳球虫对禽流感疫苗的免疫增强作用研究

为了研究柔嫩艾美耳球虫对雏鸡免疫禽流感疫苗的免疫增强作用,试验将7日龄AA肉鸡随机分为4组,每组20只,1组试验鸡皮下注射柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,同时免疫禽流感H5亚型灭活疫苗;2组试验鸡皮下注射柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,同时免疫磷酸盐缓冲液;3组试验鸡皮下注射磷酸盐缓冲液,同时免疫禽流感H5亚型灭活疫苗;4组试验鸡皮下注射磷酸盐缓冲液,同时免疫磷酸盐缓冲液。在免疫后第7,14,21,28天,各组随机取5只鸡采血、称重,采集胸腺、脾脏、法氏囊,计算免疫器官指数,采用血凝抑制试验检测血清中禽流感抗体效价。结果表明:各组试验鸡的平均体重差异不明显,柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊与禽流感灭活疫苗共免疫不会影响试验鸡的日增重;柔嫩艾美耳球虫与禽流感疫苗联合免疫可以促进雏鸡免疫器官的生长发育,提高雏鸡免疫器官指数和禽流感抗体效价。说明柔嫩艾美耳球虫可以调节机体对疫苗的免疫反应,促进雏鸡的体液免疫应答。