苎麻ISSR-PCR体系的优化

ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术,ISSR标记成孟德尔式遗传,在多数物种中是显性的,目前已经广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学当中。笔者以苎麻自交系品种为材料,研究了苎麻ISSR分析过程中的影响因素,包括10×PCRBuffer、模板浓度、Mg2 、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于苎麻ISSR分析的PCR反应体系:即在20ul反应体系中,引物浓度为1.0umol/L;模板DNA的用量为60～100ng;Mg2 浓度为2.0mmol/L;dNTP浓度为0.2mmol/L;Taq酶用量为1U。适宜的扩增程序为先94℃变性5min,再94℃变性30sec、56℃复性45sec、72℃延伸90sec共34个循环,最后72℃延伸7min,4℃保存。     

辣椒SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记(Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)是由Li和Quiros发展了一种新的分子标记技术。SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点,已经应用于在水稻、棉花、油菜、马铃薯、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、大蒜、莴苣及芹菜等植物和水稻稻瘟病的研究中,对开展遗传图谱构建、基因定位与克隆、比较基因组学、cDNA指纹图谱、生物多样性研究、预测杂种优势等研究是一个十分实用的工具。本研究对辣椒SRAP反应体系的程序、模板、Mg^2 等参数进行优化研究,结果表明：辣椒的PCR程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5循环,94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35循环,最后72℃延伸10min;25μl反应体系中,模板量为15ng,M矿为2．0mmol／L。本研究建立的辣椒SRAP体系重复性好、稳定性强。     

苎麻RAPD反应体系的构建与优化

以苎麻品种为材料,研究了苎麻RAPD分析过程中的影响因素,包括10×PCR Buffer、模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于苎麻RAPD分析的PCR反应体系：即在25μl反应体系中,引物浓度为0.4uM;模板DNA的用量为60~100ng;Mg2+浓度为1.8mM;dNTP浓度为0.2 mM;Taq酶用量为1U。适宜的扩增程序为先94℃变性4min,再94℃变性45s、38℃复性45s、72℃延伸2min共36个循环,最后72℃延伸5min,4℃保存。     

柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化

通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物.     

蚕豆SRAP标记的建立及遗传多样性分析

本研究从Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板5种因素对蚕豆序列相关扩增多态性(sequencerelated amplified polymorphism, SRAP)体系进行了优化。结果表明,蚕豆最佳PCR反应体系(25μL)为:1.0 mmol/L d NTPs,0.5 mmol//L Mg2+,0.4 U Taq酶,4.0 mmol/L引物,2.0 mmol/L的模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。利用优化的SRAP标记对12份蚕豆材料进行遗传多样性分析,研究结果表明12个材料明显聚为2个类群,类群中又有亚类。12个蚕豆品种中有些虽然来自同一地区,但亲缘关系却较远,而来自不同地区的蚕豆也显示出来很大差异,说明蚕豆材料具有丰富的遗传多样性。     

桃SRAP-PCR反应体系的建立与优化

建立适宜桃基因组DNA的SRAP-PCR扩增体系,为桃基因图谱的构建和分子标记打下基础。以桃基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从dNTPs、Mg2+、Taq酶、引物、模板5种因素4个水平对桃SRAP-PCR反应体系进行优化,所建立的体系为25μL:dNTPs为0.12 mmol/L,Mg2+为4 mmol/L,Taq酶2 U,引物为0.3 mmol/L,模板DNA50ng。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性l min,35℃复性l min,72℃延伸l min,5个循环;94℃变性l min,50℃复性l min,72℃延伸l min,35个循环,72℃延伸10 min。     

萝卜SRAP-PCR反应体系的建立与优化

以萝卜基因组DNA为模板,对其SRAP-PCR反应体系的各个主要影响因子进行了系统的优化,建立了重复性好、多态性丰富的萝卜SRAP-PCR反应体系:20 μL反应体系中,DNA 50 ng、Mg2+2.25 mmol/L、dNTP0.2 mmol/L、Taq1 U、Primer 0.7μmol/L.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、35℃复性1 min、72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min、50℃复性1 min、72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min,4℃保温.该反应体系在不同萝卜种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建、分子标记辅助选择育种等方面都有重要作用.     

烟草RAPD反应体系的建立与优化研究

以烤烟品种为材料,研究了烟草RAPD分析过程中的影响因素,包括模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq 酶、循环次数、退火温度等,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系：即在25μl反应体系中,模板用量为40ng;引物浓度为0.4μM;Mg2+浓度为2.5mM;dNTP浓度为0.2mM;Taq DNA聚合酶用量为1U。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1.5min,39个循环;最后72℃延伸5min。     

胡椒SRAP反应体系的建立和优化

建立并优化胡椒SRAP分子标记体系,为海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析、物种和品种鉴定等打下技术基础。利用单因素随机试验对胡椒SRAP-PCR反应体系中各组分（Taq DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、引物和Mg2+）的浓度进行优化,同时筛选SRAP-PCR反应的循环数和最适退火温度。通过实验确定了SRAP-PCR反应体系为：反应总体系为20 μL,其中引物0.35 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTP 0.6 mmol/L,Mg2 + 1.5 mmol/L,模板DNA 25~200 ng,同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度;最佳SRAP-PCR反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,35℃退火30 s,72℃延伸45 s,5个循环;然后94℃变性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸45 s,40个循环;最后72℃延伸7 min,4℃保存。SRAP-PCR体系适为胡椒属植物遗传多样性分析奠定了基础,并成功地应用于海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析。     

草莓SRAP反应体系优化及引物筛选

为建立草莓SRAP-PCR适宜的反应体系,以草莓品种‘丰香’为实验材料,采用单因素实验设计,对Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物浓度4个因素4水平进行优化,并在此基础上对模板DNA的浓度和退火温度进行优化。结果表明,草莓SRAP-PCR最佳反应体系为：20μL的反应体系中含10×PCR buffer 2μL,Mg²⁺ 2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,正反向引物各为0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为100 ng。扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。利用该优化体系筛选引物,从110对SRAP引物组合中筛选出29对条带清晰丰富、多态性好的引物,证明了此优化体系稳定可靠,能够用于草莓种质资源的鉴定、分子标记辅助育种等研究。