珍稀泌盐植物长叶红砂RtSOD基因的克隆及功能分析

长叶红砂是一种强旱生泌盐盐生植物,对盐渍荒漠环境具有极强的适应性。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。本研究利用已有长叶红砂转录组数据库中SOD基因的已知序列设计引物,采用PCR方法克隆得到大小为663 bp、编码220个氨基酸的SOD基因的开放阅读框,并将其定名为RtSOD。预测该基因编码蛋白分子量为55.90 kDa,理论等电点5.11。多重序列比对分析结果显示该蛋白属于Cu/Zn SOD家族,与其他植物中SOD蛋白同源性较高。系统进化分析结果显示RtSOD基因与刚毛柽柳的SOD基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示NaCl、4 ℃、PEG、H₂O₂及ABA处理均能诱导该基因表达。构建RtSOD真核表达载体,将其转化到拟南芥中,结果发现:盐、干旱胁迫条件下,转RtSOD基因拟南芥的生长状况明显优于野生型,转基因株系抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)和脯氨酸含量较野生型显著升高,H₂O₂及MDA含量较野生型显著降低。qRT-PCR检测发现转基因拟南芥中响应逆境胁迫相关基因的表达量均显著高于野生型。上述结果说明RtSOD基因的过表达可提高转基因植物的抗逆性,进一步说明RtSOD参与长叶红砂对非生物胁迫的响应,是该植物抗氧化系统中的重要元件。     

珍稀泌盐植物长叶红砂两个ＷＲＫＹ转录因子的克隆及表达分析

 根据长叶红砂转录组数据信息,选取在盐胁迫处理后表达上调明显且注释结果为ＷＲＫＹ 转录因子的两个ｃＤＮＡ 片段。通过ｃＤＮＡ 末端快速扩增技术（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ,ＲＡＣＥ）,从长叶红砂中克隆获得２个ＷＲＫＹ基因。在ＮＣＢＩ数据库比对与拟南芥At ＷＲＫＹ ３３同源性分别为７９％和８７％,因此命名为Rt ＷＲＫＹ３３-１和Rt ＷＲＫＹ ３３-２。其中Rt ＷＲＫＹ３３-２的ｃＤＮＡ 全长２１６３ｂｐ,开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ,ＯＲＦ）长度为１６８１ｂｐ,编码５７３个氨基酸;Rt ＷＲＫＹ ３３-１的ｃＤＮＡ 全长２１５５ｂｐ,开放阅读框长度为１７７６ｂｐ,编码５９１个氨基酸。氨基酸序列分析表明这两个基因均具有两个ＷＲＫＹ 结构域,属于典型的Ｉ类ＷＲＫＹ 转录因子。蛋白结构预测分析发现,两个蛋白的一级结构和二级结构在ＷＲＫＹ 结构域的氨基酸序列和结构特性的相似性较高,但是在非保守结构域部分,尤其是Ｎ 末端（１～８０ａａ之间）、第１个ＷＲＫＹ 结构域之前（１９０～２４０ａａ之间）和两个ＷＲＫＹ 结构域之间（４３０～４５０ａａ之间）等位置的差异明显,可能对两个基因功能有一定影响。半定量ＲＴ－ＰＣＲ 分析表明,４ 种非生物胁迫均能诱导这两个基因的表达,但是盐、冷和ＡＢＡ 对Rt ＷＲＫＹ ３３-２诱导尤为明显,同时Rt ＷＲＫＹ ３３-２对干旱胁迫的响应更快,因此这两个基因在长叶红砂抵御非生物胁迫的应答反应中发挥的作用可能不同。本研究为深入探索ＷＲＫＹ３３转录因子在长叶红砂中的作用机制奠定了基础。     

长叶红砂钙依赖蛋白激酶RtCDPK16的非生物胁迫应答分析

植物受到逆境刺激后,钙离子结合蛋白能够感知钙信号并将其解码,激活下游靶蛋白,从而引发胁迫应答反应,钙调蛋白激酶在其中发挥了重要作用。长叶红砂为东阿拉善-西鄂尔多斯特有的珍稀泌盐植物,对干旱、盐碱等环境胁迫具有极强的适应性。本研究基于转录组数据,克隆了长叶红砂钙调蛋白激酶RtCDPK16的开放阅读框（open reading frame, ORF）,氨基酸序列比对和进化分析显示,其与拟南芥的同源性为78.46%,与葡萄VvCDPK16同源性最高（80.97%）。基因表达特性分析显示,RtCDPK16在根茎叶中均表达,且在根中表达量最高,同时其表达水平可被氯化钠（NaCl）/聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）/冷胁迫（cold stress, cold）/脱落酸（abscisic acid, ABA）等多种环境胁迫和氯化钙（calcium chloride, CaCl₂）显著诱导。构建植物表达载体并转化拟南芥,对野生型拟南芥（WT）和过表达拟南芥（OE）株系进行干旱、盐和脱落酸胁迫,发现胁迫处理下OE株系的根长、鲜重和叶绿素含量等表型指标均显著高于WT,表明RtCDPK16的超表达使转基因株系获得了更强的胁迫耐受性;生理生化指标检测显示,胁迫处理下各株系中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（peroxidase, POD）和过氧化氢酶（catalase, CAT）等抗氧化酶活性及脯氨酸（proline, Pro）、可溶性糖（soluble sugar, SS）等渗透调节物质的含量均被显著诱导,且超表达株系显著高于WT,而过氧化氢（hydrogen peroxide, H₂O₂）/超氧阴离子（superoxide anion, O₂^-）的积累量显著低于WT;实时荧光定量（quantitativereal-time, qRT-PCR）检测发现,胁迫条件下OE株系的相关抗氧化酶基因、ABA合成和信号途径关键元件基因及脯氨酸合成基因均被显著诱导。以上结果表明,RtCDPK16在拟南芥中的超表达通过调控转基因植物中抗氧化和渗透调节系统相关基因的表达和酶活性,促进转基因植物的渗透平衡和活性氧（reactive oxygen species, ROS）稳态的维持,进而提高转基因植物的胁迫耐受性,这一过程可能是通过依赖于ABA信号的途径实现的。     

柳枝稷PvbZIP8基因的克隆与表达分析

bZIP转录因子在植物非生物逆境胁迫的响应中发挥着重要作用,本研究通过同源克隆在柳枝稷（Panicum virgatum L.）中获得PvbZIP8基因,并对该基因进行了初步的生物信息学分析,同时利用荧光定量PCR技术进行了非生物胁迫下基因表达模式分析以及组织特异性表达分析。结果显示：基因的开放阅读框长度为468 bp,编码155个氨基酸,分子式为C₇₆₁H₁₂₄₈N₂₄O₂₃S₈,分子量为17.81 kDa,为亲水性蛋白。系统进化分析表明该蛋白与哈氏黍（Panicum hallii）、谷子（Setaria italica）和糜子（Panicum miliaceum）相似性较高,并且具有典型的bZIP保守结构域,属于bZIP转录因子家族成员。定量PCR结果显示,PvbZIP8基因在盐、干旱、高温和低温胁迫下上调表达,在柳枝稷抗逆过程中发生作用。组织特异性表达分析表明,PvbZIP8在多个组织或器官均有表达,其中在根、茎、叶中表达量较高。本研究初步确定柳枝稷PvbZIP8基因响应抗逆性反应,并为进一步研究柳枝稷PvbZIP8基因的生物学功能奠定基础。     

白羊草BiMYB52基因的克隆及转基因拟南芥抗旱性表达分析

白羊草(Bothriochloa ischaemum)是一种耐旱的优良乡土草种。为了探索白羊草转录因子MYB的结构和功能,本研究以白羊草转录组测序中筛选出的一段对干旱胁迫响应表达量变化显著的MYB序列为基础,采用基于拓扑异构酶快速克隆法从白羊草中克隆了一个R2R3-MYB基因BiMYB52,该基因编码237个氨基酸。为了深入研究BiMYB52基因的抗旱性,利用染色体步移技术扩增出了BiMYB52启动子序列,构建了pCAMBIA1301-BiMYB52过表达载体,采用农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行遗传转化,然后对野生拟南芥和转基因拟南芥进行干旱胁迫处理。结果表明,干旱胁迫复水后,转基因拟南芥的存活率显著高于野生拟南芥,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量是干旱胁迫后转基因拟南芥的显著低于对照,脯氨酸(Proline, Pro)含量则显著高于对照。由此推测BiMYB52基因可能增加了拟南芥对干旱胁迫的抵抗能力。这为白羊草抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

草地早熟禾BBML基因的克隆及表达模式分析

为探究婴儿潮(BABY BOOM,BBM)基因诱导草地早熟禾(Poa pratensis)体胚发生的潜在功能,本研究采用同源克隆方法获得PpBBML(PpBBM-like)基因,并对其进行生信分析、亚细胞定位和表达模式分析。结果表明：PpBBML编码的蛋白具BBM特有的bbm-1基序且定位于细胞核,并与小麦(Triticum aestivum)BBM亲缘关系最近。PpBBML的表达水平存在组织特异性,表达量为花药>茎基>幼叶>根茎>老叶>不定根。6-BA,NAA(除0 h外),MeJA和EBR(除4 h外)处理后的PpBBML表达量均高于CK;GA₃处理后的PpBBML表达量均低于CK。在仅添加生长素的愈伤组织诱导培养基上,其表达量在接种第2 d最高。综上所述,PpBBML是AP2亚家族的转录因子基因,其表达量在幼嫩组织中最高且受到不同激素的诱导,并在愈伤组织形成初期表达量急剧上升,因此,该基因可能具有诱导草地早熟禾胚性愈伤组织发生的潜力。     

蒙农杂种冰草AcdMYB1基因克隆及表达分析

‘蒙农杂种’冰草(Agropyron cristatum×A.desertorum‘Hycrest-Mengnong’)具有干草产量高,适口性好,抗逆性强的特点,是中国北方干旱地区建立人工草地的适宜草种。本研究利用同源克隆方法从‘蒙农杂种’冰草中克隆得到的1个MYB类转录因子基因(命名为AcdMYB1),对其进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明：该基因cDNA序列长度为1 161 bp,包含完整开放阅读框(ORF)为969 bp,编码322个氨基酸,具有MYB转录因子的保守结构域。AcdMYB1与小麦族的山羊草、普通小麦、野生二粒小麦的同类基因亲缘关系最近,序列一致性均在90%以上。组织表达中AcdMYB1基因在穗中的表达量最高,其次为叶、根,茎中表达量最低;在模拟自然干旱胁迫下,能够显著降低AcdMYB1的表达水平。烟草亚细胞定位显示,该蛋白定位于细胞核。本研究为进一步探索‘蒙农杂种’冰草AcdMYB1基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。     

大叶落地生根KdSRG1基因的克隆、表达分析及自激活检测

为探究大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana)中衰老相关基因1(Senescence-related gene 1,SRG1)的功能,以野生型大叶落地生根为材料,克隆KdSRG1基因,对其进行生物信息学分析、亚细胞定位和基因表达分析。结果表明：KdSRG1基因开放阅读框为219 bp,编码72个氨基酸;KdSRG1蛋白是一个亲水性的不稳定酸性蛋白,定位于细胞核和细胞质,不含跨膜结构和信号肽,并且具有物种上的特异性;该基因在大叶落地生根的不定芽和叶中的相对表达量较高,说明其参与不定芽和叶的生长调控;通过分析其启动子顺式作用元件,推测KdSRG1基因参与植物分生组织表达和栅栏细胞分化过程,并且其表达可能受光信号、脱落酸(Abscisic acid, ABA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MeJA)调控,同时可能在植物逆境胁迫调控方面发挥作用;自激活检测表明KdSRG1蛋白没有自激活活性,可用于后续的酵母双杂实验。本研究为进一步研究KdSRG1基因的作用机制及功能奠定了基础。     

长叶红砂RtVAMP2-2基因克隆及功能验证

长叶红砂(Reaumuria trigyna)是一种珍稀泌盐盐生植物,其特有的盐腺结构是长叶红砂适应盐渍荒漠环境的关键,膜泡运输参与该植物的盐腺分泌过程.本研究基于盐胁迫下长叶红砂的转录组数据,克隆获得膜泡运输相关基因RtVAMP2-2.生物信息学分析发现,RtVAMP2-2基因的开放阅读框为1074bp,编码357个...     

白三叶TrMYB1R1全长克隆及转录表达分析

R1-MYB是MYB转录因子家族中的一亚类,可能参与植物非生物胁迫应答。通过RT-PCR和RACE技术,在白三叶(Trifolium repens)中成功克隆出一个MYB转录因子TrMYB1R1,基因全长1 403 bp,编码297个氨基酸残基。通过生物信息学分析,发现TrMYB1R1蛋白含有一个MYB结构域,属于MYB-related蛋白,保守域形成3个α-螺旋;亚细胞定位预测该蛋白可能位于细胞核中。同源进化分析结果显示TrMYB1R1蛋白和豆科植物MYB蛋白亲缘较近,蛋白进化符合植物进化分类。非生物胁迫和外源激素处理结果表明,该基因在白三叶根和叶中均受到诱导调节。在聚乙二醇(PEG)水分胁迫、镉胁迫、4℃冷处理及35℃高温处理下,白三叶TrMYB1R1表达受到抑制,且该基因对镉、冷及热处理响应强烈,对PEG处理响应较弱;而在NaCl胁迫处理下该基因受到诱导表达;同时,脱落酸(ABA)处理前期抑制TrMYB1R1表达,但细胞分裂素(CTK)显著诱导该基因表达。这些结果表明,该基因可能参与多种非生物胁迫应答并可能受激素调控,但对TrMYB1R1在白三叶中的功能及调控作用仍需进一步研究。     

红砂肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

肌动蛋白(Actin)基因是研究植物功能基因表达模式中最常用,也是最重要的内参基因。本研究以泌盐型强旱生植物红砂(Reaumuria soongorica)地上部总RNA为模板,根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR方法克隆其Actin基因片段。序列分析结果表明,该基因片段长度为598 bp,编码198个氨基酸,与GenBank中登陆的其他植物Actin基因核苷酸序列和氨基酸序列的一致性分别在82%和90%以上,说明其为Actin基因片段,命名为RsACT。进化分析显示,RsACT与陆地棉(Gossypium hirsutum)和白杨(Populus trichocarpa)肌动蛋白的亲缘关系最近。     

猪DDX1基因的克隆、序列分析及表达

根据已知人、小鼠、牛、鸡、犬和恒河猴等物种的DEAD-box解旋酶1(DEAD-box helicase 1,DDX1)基因mRNA序列设计引物,从猪肾传代细胞系(PK-15)中克隆DDX1基因编码区(CDs)序列,对该基因进行生物信息学分析、组织表达谱分析。进一步将猪DDX1基因CDs序列克隆至真核表达载体pCMV-Tag2B,构建的重组真核表达质粒转染PK-15细胞后运用Western blot和间接免疫荧光试验检测DDX1基因的真核表达。结果显示:成功克隆了猪DDX1基因的cDNA序列(GenBank登录号为KU522467),其开放读码框全长为2 223bp,编码740个氨基酸;与牛、鸡、黑猩猩、犬、人、小鼠、大鼠和恒河猴的氨基酸序列同源性分别为98.8%、93.5%、97.6%、98.8%、97.7%、97.0%、97.6%和97.8%。表达谱分析表明,猪DDX1mRNA在不同组织中的表达水平存在差异,表现为脂肪、肝脏和脾脏中高表达,而在胃、心脏和肌肉中表达较低。成功构建了猪DDX1基因真核表达质粒,经证实目的基因可以在真核细胞中特异性表达,且表达的DDX1蛋白主要定位于细胞质中,少量定位于细胞核中。结果表明:本试验克隆了猪DDX1基因的序列,分析了其在不同组织的表达规律,并构建了DDX1基因重组表达质粒,为该基因下一步的功能学研究奠定了基础。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

盐生草Actin基因片段的克隆及表达

根据藜科植物的肌动蛋白（Actin）基因编码区保守序列设计一对简并引物,提取盐生草（Halogeton glomeratus）叶片的总RNA,运用RT-PCR技术扩增出Actin基因的核心序列并连接到pMD19-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析表明,盐生草Actin基因核心序列长度为598 bp,编码198个氨基酸,并在GenBank中注册,登录号为KF699314,由盐生草Actin基因推导的氨基酸序列与其他几种耐盐植物的同源性均在94%以上,具有高度的保守性。采用荧光定量RT-PCR技术分析其Actin基因在盐生草不同器官的表达情况,结果显示其表达量恒定无差异,表明克隆的Actin基因可作为盐生草内参基因来研究其相关耐盐基因的表达。     

羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析

采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。     

少孢节丛孢菌新疆分离株几丁质酶AO-14基因的克隆表达

利用RT-PCR扩增获得少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1几丁质酶AO-14目的基因片段,对该基因进行克隆和分子特征分析;构建重组表达质粒p ET32a-AO14,转化到大肠杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot分析表达的重组蛋白。结果表明,AO-14基因c DNA全长为1 200 bp,编码399个氨基酸;编码蛋白几丁质酶AO-14属于糖苷水解酶18家族,具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGG和DGXDXDWE,氨基酸序列的第131~139为活性位点所在区域,无信号肽序列。SDS-PAGE分析结果显示,AO-14表达产物的分子质量约为60 ku;Western-blot分析结果表明,重组蛋白可以与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应,证实在大肠杆菌中实现了少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-14基因的表达,为进一步研究少孢节丛孢菌几丁质酶AO-14生物学功能奠定了基础。     

山羊FGF1基因克隆及表达特性

以简州大耳羊为试验动物,采用RT-PCR技术克隆FGF1基因,采用胶原酶消化法获得山羊原代前体脂肪细胞,利用荧光定量PCR(qPCR)技术检测FGF1的表达差异,并与IMF含量进行相关分析。结果显示,成功克隆山羊FGF1基因(GenBank登录号:KT899959)序列1 165bp,其中开放阅读框468bp,编码155个氨基酸。FGF1在各组织中存在广泛表达,且在心脏和脂肪组织中高表达,极显著高于肝脏、脾脏、肾脏和肌肉组织(P0.01)。FGF1mRNA表达量与山羊背最长肌和臂三头肌IMF含量呈显著正相关(P0.05)。随着脂肪细胞分化的进行,FGF1mRNA表达水平呈上升趋势,且在第5天达到最高,随后显著下降(P0.05)。FGF1可能在山羊脂肪细胞分化早期发挥正调控作用,本研究结果为揭示FGF1基因在山羊肌内脂肪沉积中的作用及机制提供重要数据。