汉坦病毒L基因的分段克隆及原核表达

为原核表达汉坦病毒(HV)L蛋白,本研究根据HV 76-118株全长L基因序列分段设计合成了6对引物.通过RT-PCR方法分段扩增L基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达.SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白.Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应.     

人瘦素基因的克隆及原核表达

为了获得大量的、可供试验研究和制作生物反应器的人瘦素蛋白,从人脂肪组织中提取总RNA,用RT-PCR法获得了编码人瘦素(leptin)167个氨基酸残基的cDNA序列,并克隆至载体pMD19-TSimple上进行序列分析。以克隆的人瘦素cDNA为模板,用特异引物扩增瘦素基因,经EcoRI和BamHI双酶切,定向插入高效原核细胞表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE检测。结果:用RT-PCR法扩增得到的cDNA片断序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank公布的人瘦素基因序列一致;SDS-PAGE分析基因表达产物,在20 ku处有一特异条带,说明重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中可表达人瘦素蛋白。     

贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin基因的克隆及原核表达

采用特异性引物自贵州黑羽乌骨鸡胃部组织克隆了Ghrelin的基因,基因全长2330bp,含有4个外显子,3个内含子.采用RT-PCR技术,获得了Ghrelin cDNA片段(563 bp),序列分析推测,通过可变剪切可产生两段mKNA,cDNA编码区与基因组中的编码区完全一致.黑羽乌骨鸡Ghrelin基因与已知鸡种比较有13～18个碱基不同,相似性为99.1%～99.3%,但其氨基酸序列完全一样,表明禽类的Ghrelin多肽高度保守.将其中Ghrelin编码区亚克隆到原核表达载体pTYB11中,经序列测定碱基序列正确,获得重组质粒pTYB11/G.在IPTG的诱导下,重组质粒在大肠杆菌ER2566中获得表达.当OD600=0.5,IPTG为浓度1 mmol/L,诱导5小时的表达量最高,融合蛋白占细胞总蛋白的40%.采用几丁质结合的预装柱对表达产物进行纯化,产率约为5 mg/L培养液.     

枯草杆菌多重耐药基因bmr的克隆及原核表达

根据BenBank上已公布的多重耐药基因bmr的编码序列设计1对引物．以枯草杆菌基因组为模板，扩增出1170bp的DNA片段，将所得片段与pMD18T载体连接，转化到DH5α大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其扩增片段测序结果与文献报道序列同源性达98．81％。将该片段定向克隆到pET-28a（＋）表达质粒中。提取质粒转化到BL21（DE3）中，经1mmol／l。IPTG诱导阳性菌．通过SDS-PAGE检测出bmr基因的表达产物。     

布鲁氏菌eryA基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

为分析羊种布鲁氏菌Rev.I株的基因结构、功能及作为诊断抗原的可能性,从Rev.I株基因组中扩增eryA基因片段,构建重组质粒pET-30a-eryA并进行原核表达、Western-blot检测,同时对该基因进行生物信息学分析。结果显示:本试验成功克隆并表达了eryA基因;经Western-blot检测发现,该基因编码蛋白可与阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性;生物信息学分析显示,该蛋白没有跨膜区结构,无信号肽,二级结构中α-螺旋比重最大;抗原表位分析显示:该蛋白含有较多的抗原决定簇。因此,推测eryA蛋白有望作为布鲁氏菌的免疫诊断抗原,这为进一步探索布鲁氏菌基因工程疫苗的研制及iELISA诊断试剂盒的建立奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌dhbC基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli） DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093 bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47 ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C₁₈₆₆H₂₉₆₈N₅₄₄O₅₆₂S₁₅,分子质量为42 496.3 u,理论等电点（pI）为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性（GRAVY）为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,其二级结构以α-螺旋（41.94%）和无规则卷曲（31.46%）为主。     

羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达

为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。     

梅花鹿IFN-α基因的克隆与原核表达研究

为研究梅花鹿IFN-α的抗病毒功能和分子机制,根据GenBank中牛IFN-α基因序列(A00145),设计并合成1对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-α全基因核苷酸序列。序列分析表明梅花鹿IFN-α基因全长570 bp,编码189个氨基酸,其中含18个氨基酸的信号肽和169个氨基酸的成熟多肽,存在1个潜在跨膜区,基因随不同物种发育进化地位表现出种属间的差异性。在此基础上,合成1对引物,扩增梅花鹿IFN-α成熟肽核苷酸序列,构建pET28a-IFNα原核重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,在24 kd左右出现特异性蛋白带,表达产物主要为不溶性的包涵体,表达量占菌体总蛋白的34.04%,且表达产物与抗His标签抗体可发生特异性反应。将Ni柱纯化的pET28a-IFNα诱导表达产物复性后,细胞病变抑制法检测表明表达产物具抗病毒活性。研究结果为梅花鹿IFN-α蛋白抗病毒分子机制的研究及抗病毒药物的开发奠定了基础。     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物，以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板，扩增出一约1000bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中，并将重组质粒转化E．coli BL21（DE3），用1．0mmol／L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示，F基因的表达量约占细菌总蛋白的35％。SDS-PAGE电泳显示，表达产物的分子质量约为55ku，与预计大小相符；经Western-blotting试验进一步证实，该基因获得了正确表达。     

猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析

采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。     

羊草种子萌发相关基因的筛选及表达分析

前期实验表明,变温处理(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)可显著提高羊草种子的萌发率,且羊草种子萌发中的第1天是接受变温信号的关键时期。以此为研究基础,结合羊草种子变温萌发的转录组测序数据,针对羊草种子萌发初期对变温处理的响应筛选出与种子萌发、休眠及低温相关的基因24个,利用测序结果中这些基因的RPKM值制作基因表达热图并分析其表达差异。以萌发率高、低的两种羊草种质的种子为材料,对24个基因在恒温12 h(28 ℃)和变温1 d(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)萌发处理中的表达分别进行了定量分析。结果表明,与恒温对照相比,变温处理12 h后,表达明显上调的基因有SAIN1,PP2C62,EXPB3,EXPB4,GA3ox,EXPA2和EXPA7,而表达明显下调的基因有bHLH49,GID1,ABI8,Chi1,11833,CBF3,NAC2,PP2C72,SAIN2和5423。通过进一步分析相关基因在高、低萌发率两个种质中表达的差异,筛选出其中可能与羊草种子萌发相关的基因有几丁质酶基因Chi1,转录因子基因CBF3,羊草新基因5423,赤霉素合成基因GA3ox,细胞松弛素蛋白基因EXPB4和羊草新基因SAIN1,将为下一步阐明羊草种子萌发的分子作用机理奠定基础。     

家蝇溶菌酶1基因的克隆、序列分析及原核表达

采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）,对鸡致病性大肠杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减文库（SSH）中筛选得到家蝇溶菌酶1基因（（Musca domestica lysozyme-1,MdL-1）进行扩增,测序分析得到一个全长为537bp的cDNA片段,其开放阅读框（ORF）432bp,与Genbank中登录号为AY344589．1基因同源性为96％。构建重组表达质粒pET-32a-MdL-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β—D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析显示。表达产物大小约为34kD,与预期蛋白大小一致。结果表明,利用RACE技术克隆得到MdL-1全长基因并在大肠杆菌中获得了表达,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

火生态因子对内蒙古草原羊草种群的影响

用控制火烧的方法,研究了火烧对内蒙古草原羊草种群的影响。结果表明,火烧不利于羊草种群枝条的生长发育,抑制羊草的生长高度,降低其单枝干重。但在羊草样地内,由于火烧可以极大地提高羊草种群的密度,增加种群的总地上生物量,因此从种群整体角度来看火烧对羊草群落中羊草种群的生长发育具有积极的促进作用。从研究结果来看,每隔几年（大约4～5年）适当火烧一次非常有利于羊草种群的发展,火烧效应至少可以维持4～5年的时间。然而,连年重复火烧将对羊草种群产生不利的影响。此外,火烧对羊草种群的作用效应受环境状况的强烈影响,在水分条件和土壤理化性状较差的大针茅群落中,火烧会对羊草种群产生不利的影响。     

松嫩羊草草甸羊草、碱茅群落土壤酶活性比较研究

研究了松嫩羊草草甸羊草,碱茅群落的过氧化氢酶、脲酶、转化酶和多酚氧化酶活性的季节变化规律及垂直变化规律,并对上述4种土壤酶活性与各理化因子之间进行了相关分析,结果表明,2种群落的4种酶活性季节动态均呈单峰型曲线,并具有较强的规律性,过氧化氢酶,脲酶,转化酶活性的高峰值出现在7、8月,而多酚氧化酶活性的高峰值则出现在9、10月,并且作为优势群落的羊草群落,其各月份的土壤酶活性多数要大于碱茅群落,土壤酶活性一般是随土层的加深而逐渐递减的,只有碱茅群落的多酚氧化酶活性是呈现“高－低－高”的趋势,相关分析的结果表明过氧化氢酶,脲酶,转化酶活性与土壤肥力呈正相关,而多酚氧化酶与其相关程度不大。     

羊草草原改良措施与效果

1980～1997年改良退化草原4349.2km²,主要改良措施:1浅耕翻改良,有效利用15年,年均增产90.5%。2松土改良,有效利用年限6～10年,平均增产70.35%。3施肥改良,其中施尿素187.5kg/hm²,产草量提高3.2倍,施厩肥30～37.5t/hm²,第二年增产53.5%。4引种国内外苜蓿品种25个,筛选出一批耐寒抗病品种,每年割两茬,干草产量4927.5kg/hm²,是对照的3倍。表现好的品种有黄花苜蓿、肇东苜蓿、公农1号苜蓿、公农2号苜蓿、草原2号苜蓿。5补播改良效果不佳。     

羊草有性繁殖相关性状的变异和相关分析

对11个羊草有性繁殖相关性状进行了考察,对287个单穗的穗长、小穗率、小花率、结实率、单穗拉重、千拉重、结实率及每小穗的小花率的一级和二级数据进行了系统的相关和回归分析。结果表明,各性状按变异系率的大小依次排序如下：单穗拉重＞结实率＞小花率＞每小穗的小花率＞结实宰＞小穗率＞穗长＞千拉重;穗长、小穗率等7个性状均与单穗拉重有显著正相关,但结实率与单穗拉重的相关系数最大(0．908),应当作为评价羊草有性繁殖的重要指标;千拉重与单穗拉重虽也存在显著正相关,但相关系数较小(0．197),而研究较多的结实率性状与单穗粒重的相关系数则居中(0．506)。根据标准回归系率,本研究确定了如下最优多元线性回归方程：y＝一0．342十0．003X1十0．109X5十0．001X4十0．001X5。     

羊草与灰色赖草及其杂交种的耐盐生理特性比较

用不同浓度的复盐(NaCl 60%,Na2SO4 40%)进行根际盐分胁迫处理,研究了羊草(Leymus chinensis)、灰色赖草(Leymus cinereus)及其杂交种的耐盐生理特性.结果表明,在0.2%、1.0%和2.0%盐浓度胁迫处理下,两亲本及其杂交种叶片均表现相对含水量(RWC)逐渐降低,相对电导率、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性逐渐增加,但亲本羊草和杂交种的SOD酶活性在2.0%盐浓度胁迫下,酶活性开始降低.而且杂交种对盐胁迫的敏感性与亲本灰色赖草接近,小于另一亲本羊草.     

羊草生物学研究进展

羊草的生物学研究对改善我国北方草原生态环境和发展草原畜牧业均具有重大意义.结合近年的科研工作,在查询已有资料的基础上对羊草生物学这一领域所取得的成果进行了综合分析与评述,内容包括种质资源与生物多样性、生理和繁殖生物学以及生物技术研究等.提出羊草生物学目前尚未解决的几个问题,建议及时充分利用水稻基因组已经取得的成果加快羊草生物学的研究步伐,使研究工作向深度发展.     

羊草与灰色赖草杂种F1再生体系的建立

对羊草(Leymus chinensis)与灰色赖草(Leymus cinereus)杂种F1幼穗进行离体培养,建立了杂种F1植株再生体系.结果表明:不含任何激素的MS培养基是最佳的分化培养基,分化成苗率为66%;2,4-D对愈伤组织的诱导及其质地的改造有重要作用;3.0 mg/L 2,4-D MS培养基愈伤组织诱导率最高,为68%;2.0 mg/L 2、4-D MS诱导的愈伤组织胚性最强;诱导率与分化率没有直线对应关系;再生体系的建立为杂种F1育性恢复的研究奠定了基础.