细叶百合鳞茎花芽分化过程观察

以细叶百合(Lilium pumilum)鳞茎为试材,利用石蜡切片和扫描电子显微技术,对细叶百合鳞茎花芽分化全过程进行形态学和组织细胞学观察,研究细叶百合鳞茎在自然越冬状态下花芽的发生、发育进程。结果表明,细叶百合鳞茎芽顶端生长点9月中旬开始由营养茎端向生殖茎端转变,11月中旬封冻前,芽顶端生长点最下面1～2个小花原基已完成花被原基的分化,翌年春季解冻后,继续进行花芽分化,至5月中旬前,整个花序分化完成。整个花序分化历时8个月左右,形成4～7个花蕾,并可将百合花芽分化划分为未分化期、分化初期、小花原基分化期、花被原基分化期、雄蕊和雌蕊原基分化期、整个花序形成期6个时期。     

细叶百合LpWRKY20基因对非生物胁迫的响应及抗旱性分析

以细叶百合LpWRKY20基因为研究对象,通过荧光定量(qRT-PCR)分析该基因在不同非生物胁迫中的表达,结果表明,在不同非生物胁迫中该基因表达量存在差异。利用叶盘法将pBI121-LpWRKY20-GFP植物表达载体转入烟草并获得转基因株系。在干旱胁迫条件下,转基因植株的表型优于野生型;转基因植株超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均高于野生型,且随着时间的延长这种清除体内自由基的能力在显著升高,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型,说明转基因植株细胞膜受损程度较低,具有较强的自我修复能力。干旱条件下表型及生理指标的变化均表明转基因植株具有较强的抗旱性,初步推断LpWRKY20具有抗旱的功能。     

细叶百合冷藏过程中鳞茎保护酶活性与休眠解除的关系

以细叶百合为试材,通过冷藏(5℃)解除鳞茎休眠,研究了细叶百合鳞茎解除休眠过程中鳞茎保护酶活性与糖代谢的变化规律。结果表明,鳞片、顶芽及鳞茎盘SOD活性在冷藏0~24 d内下降,除顶芽外,鳞茎各部位POD活性在0~24 d内呈下降趋势,外鳞片、顶芽及鳞茎盘中CAT活性在冷藏0~12 d内下降,冷藏中后期,SOD、CAT、ASP 活性升高,鳞片中POD的活性下降,顶芽及鳞茎盘POD、PPO在冷藏中期上升。各种代谢相关酶在不同器官中的作用并不完全相同。在低温处理36~60 d内,ASP、CAT活性快速上升,后期趋于稳定。SOD活性最低点出现在冷藏36~60 d,鳞茎各部位淀粉与CAT、PPO、ASP均表现为负相关性,SOD、POD、PAL与鳞片中淀粉表现为正相关性。36 d是鳞茎解除休眠的起点,60 d时鳞茎基本解除休眠。     

百合鳞茎休眠解除过程中差异蛋白表达分析

通过低温处理打破细叶百合(Lilium pumilum)鳞茎休眠,利用荧光差异凝胶电泳和质谱技术,借助生物信息学分析手段,分析百合鳞茎休眠解除过程中蛋白质组的变化,以期进一步理解百合鳞茎休眠机制奠定基础。结果表明,分离得到31个差异表达蛋白点;相对于休眠鳞茎,休眠解除鳞茎中上调表达的蛋白点有15个,下调表达的蛋白点有16个;应用MS质谱成功鉴定12个差异蛋白点,按功能划分为6类,主要为胁迫类蛋白,可能涉及鳞茎内物质的代谢过程,进而调控鳞茎的休眠解除;根据细叶百合鳞茎休眠解除过程中差异蛋白表达谱比较,获得了几种与鳞茎休眠相关的蛋白质,鳞茎休眠时胁迫类蛋白高表达,休眠解除时蛋白水解酶类高表达。     

细叶百合低温解除休眠过程中鳞茎细胞淀粉粒及花芽分化的变化

以细叶百合为试材,通过低温(5℃)解除鳞茎休眠,研究了休眠解除过程中鳞茎细胞的淀粉粒的变化及细叶百合花芽分化的变化过程。通过石蜡切片和实体显微结构观察,结果表明,低温冷藏期间,顶芽生长锥的高度和宽度逐渐增加,细叶百合花芽分化主要分为4个时期,0~48 d为小花原基分化期,60 d为外轮花被原基分化期,72 d为内轮花被原基分化期,84 d为雄蕊和雌蕊原基分化期;鳞片及顶芽细胞内淀粉粒数量随着冷藏时间的延长逐渐减少。冷藏0~24 d内,鳞茎细胞没有进行有丝分裂,冷藏36 d以后细胞分裂数量逐渐增加,冷藏84 d分裂期细胞数量增加到2.6个。     

柞蚕凝集素ApIML基因的克隆与表达

在昆虫的免疫防御系统中,凝集素介导的免疫反应起着重要作用。本文克隆了柞蚕凝集素蛋白基因ApIML,序列分析表明：ApIML含有927bp的开放阅读框,编码309个氨基酸。柞蚕凝集素属于分泌型蛋白质,N端有21个氨基酸组成的信号肽,含有2个糖识别结构域。系统进化分析显示ApIML与二化螟Cs-1属于同一个分支,序列相似度为70.16%。构建了ET28a-ApIML原核表达载体,经SDS-PAGE检测发现蛋白在BL21(DE3)中成功表达,并且在Ca²⁺存在时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有凝集作用。     

鸡Mx基因的克隆与原核表达

本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白.利用poly Ⅰ:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测.表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku.说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础.     

细叶百合低温解除休眠过程中鳞茎内糖分及相关酶的研究

通过低温处理打破细叶百合鳞茎休眠,探讨细叶百合鳞茎解除休眠过程中的糖类化合物及蔗糖、淀粉代谢酶的变化规律。结果表明,鳞茎休眠解除过程中伴随着旺盛的糖类代谢活动,淀粉含量下降,淀粉酶活性升高。内层鳞片在冷藏60 d时可溶性糖含量达到峰值,贮藏前期,蔗糖含量,蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性上升,SPS和SS协同控制蔗糖代谢及转运。冷藏条件下鳞片及顶芽内淀粉向可溶性糖方向代谢过程中促进了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活性的增加。各种淀粉代谢相关酶在鳞茎冷藏不同时期和不同部位的作用规律不同。鳞茎各个部位总可溶性糖含量与蔗糖、葡萄糖含量及淀粉磷酸化酶(SP)、SS、α-及β-淀粉酶活性都存在显著或极显著的正相关性。糖类代谢成为鳞茎休眠解除的物质基础。     

新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因与GroEL基因的克隆及其原核表达

根据已发表的牛流产型布鲁氏菌HtrA（High temperature requinnent A）基因、GroEL（热休克蛋白）基因设计特异性引物，从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组中扩增出HtrA、GroEL基因片段，将HtrA、GroEL基因片段纯化后分别克隆到T载体上测序，结果表明新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因片段长1542bp，编码513个氨基酸，与发表的牛种（B．abortus）、羊种（B．melitensis）、猪种（B．suis）的HtrA基因序列的同源性分别为99．68％、99．81％、99．55％。GroEL基因片段长1641bp，编码546个氨基酸，与B．melitensis、B．suis以及B．aborms GroEL基因的核苷酸序列同源性分别为99．88％、99．82％、99．88％。HtrA基因和GroEL基因与发表的B．abortus、B．melitensis、B．suis的HtrA基因和GroEL基因序列的具有很高的同源性。按正确的阅读框架分别将两基因片段定向克隆到表达载体pET．28a上，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和western blot分析表明，HtrA、GroEL基因能在大肠杆菌中成功表达，表达的蛋白分子量都约为60Ku，并能和布鲁氏菌免疫兔子产生的抗体发生特异性的结合。     

奶牛骨钙素基因的克隆与原核表达

以奶牛骨组织提取的RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增出奶牛骨钙素全长cDNA，然后将扩增产物重组到PMD-18T载体中，测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，奶牛骨钙素全长cDNA为303bp，编码100个氨基酸，与GenBank中的X53699的序列完全相同。通过加端PCR技术连接单链DNA片段人工定点同义突变，将奶牛骨钙素成熟蛋白基因中的大肠杆菌稀有密码子同义突变为大肠杆菌常用密码子并亚克隆至PET-32a表达载体．转化到宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，成功表达出奶牛骨钙素融合蛋白。     

兔豆状囊尾蚴Tp14基因的克隆及其序列分析

为鉴定兔豆状囊尾蚴(C.pisiformis)合适的诊断或免疫用抗原,本研究根据带科其他种属绦虫14ku基因的保守区设计引物,利用RT-PCR从C.pisiformis总RNA中成功扩增出长度为261bp的基因片段,命名为Tp14,预测其编码87个氨基酸。对其核苷酸同源性分析表明,该基因序列与泡状带绦虫、细粒棘球蚴、猪带绦虫基因序列的相似性均大于85%,处于同一进化分支上,表明该基因具有种属特异性;同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原。     

普陀山苔草植物络合素合成酶CpPCS基因克隆及其在叶中的表达分析

以超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshan)为材料,克隆其植物络合素合酶基因CpPCS的cDNA全长序列。同时,对其进行重金属胁迫处理,研究该基因在叶中的表达特点。结果表明,该基因cDNA序列全长1 461bp,可编码486个氨基酸;与其它植物同源基因对比显示,它们的氨基酸序列相似性在63%左右;通过构建进化树发现,普陀山苔草CpPCS与小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)及芦苇(Phragmites australis)等单子叶植物亲缘关系最近;荧光定量RT-PCR分析结果显示,CpPCS基因及CePCS基因受重金属铅锌胁迫上调表达,其中在叶中的表达量显著增加(P0.05)。通过普陀山苔草植物络合素合酶蛋白基因进行了克隆鉴定,探讨该基因的结构、进化关系及其参与普陀山苔草重金属胁迫的应答模式,为进一步培育重金属污染土壤修复的植物奠定基础。     

少孢节丛孢菌新疆分离株几丁质酶AO-14基因的克隆表达

利用RT-PCR扩增获得少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1几丁质酶AO-14目的基因片段,对该基因进行克隆和分子特征分析;构建重组表达质粒p ET32a-AO14,转化到大肠杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot分析表达的重组蛋白。结果表明,AO-14基因c DNA全长为1 200 bp,编码399个氨基酸;编码蛋白几丁质酶AO-14属于糖苷水解酶18家族,具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGG和DGXDXDWE,氨基酸序列的第131~139为活性位点所在区域,无信号肽序列。SDS-PAGE分析结果显示,AO-14表达产物的分子质量约为60 ku;Western-blot分析结果表明,重组蛋白可以与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应,证实在大肠杆菌中实现了少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-14基因的表达,为进一步研究少孢节丛孢菌几丁质酶AO-14生物学功能奠定了基础。     

扁穗冰草转录因子基因的克隆和表达特性的分析

根据禾本科转录因子cbf,dreb,myb基因已经报道的核酸序列保守区设计引物,使用RT PCR技术首次在扁穗冰草（Agropyron cristatum）中克隆3个转录因子部分片段,分别将其命名为ACcbf,ACdreb,ACmyb。利用半定量RT PCR技术研究这3个基因在冷胁迫及干旱胁迫下的表达趋势。结果表明,ACcbf基因对温度敏感,同时对干旱胁迫有一定程度的响应;ACdreb基因对冷胁迫和干旱胁迫都较为敏感;ACmyb基因则对干旱胁迫敏感,而对冷胁迫不敏感。     

伪狂犬病病毒Ea株UL14基因的克隆、序列分析及表达

从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中克隆含UL14基因的BamHⅠ第3片段并进行序列分析。根据测定的序列设计1对能扩增UL14基因完整编码区的引物,PCR扩增UL14基因并将其插入原核表达载体pGEX-KG,获得原核表达质粒pKG-UL14,转化BL21（DE3）,在IPTG诱导下,GST-UL14融合蛋白获得高效表达,表达产物的相对分子质量为44 000,并以包涵体形式存在。纯化的表达产物免疫兔,获得了针对UL14蛋白的高效价多抗血清。进一步将UL14基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL14,转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察发现,转染后24、48 h的融合蛋白EGFP-UL14主要定位在胞浆,但转染后72 h的融合蛋白主要定位在细胞核。上述研究结果为进一步阐明UL14的结构与功能奠定了基础。     

甘菊CBL基因的克隆与表达分析

基于已建立的甘菊ESTs文库,检索到了CBL基因4个不同的EST序列;采用RACE技术获得了它们的全长序列,并命名为ClCBL1-4。将甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)ClCBL与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CBL进行多重序列比对发现,它们都含有4个结合钙离子的EF-hand结构域,且ClCBL1在N端有一个豆蔻酰化序列(MGCXXSK/T)。采用RT-PCR技术,分析了甘菊中CBL基因的表达与不同逆境胁迫的关系,表明甘菊CBL基因的表达在冷、干旱、热、盐及ABA胁迫中可被不同程度地诱导,而在非逆境胁迫条件下,甘菊CBL基因在根、茎、叶及花等不同器官中均有表达,且表达量相对一致。这些结果说明该家族基因参与了植物非生物逆境胁迫的抵御。     

长叶红砂RtMYB1基因的克隆及表达

MYB转录因子家族在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥着重要的调控作用。基于转录组测序数据,从珍稀泌盐盐生植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)中克隆一个MYB转录因子基因,命名为RtMYB1。RtMYB1基因具有780bp的ORF(open reading frame)序列,编码236个氨基酸残基组成的蛋白。RtMYB1能够被盐、冷、高温、紫外照射(UV)和干旱(PEG)5种非生物胁迫诱导表达,这表明RtMYB1基因可能参与长叶红砂响应非生物胁迫的调节途径。本研究为深入了解长叶红砂的抗逆机理及发掘优异的抗逆基因奠定了基础。