水稻白化转绿和穗顶端退化突变体vpa1的遗传分析和基因定位

目的 通过对水稻转绿和穗顶端退化等突变体的研究,可以鉴定更多与叶绿体发育和穗发育相关的基因。方法 在常规种植条件下比较突变体vpa1（virescent and panicle abortion 1)表型及主要农艺性状差异,利用分离群体分析和图位克隆法进行相关基因定位。结果 突变体vpa1表现苗期白化,并逐渐转绿恢复成正常叶色,抽穗后可明显观查到穗顶端退化表型。vpa1的主要农艺性状除了结实率以外,株高、穗长、每穗实粒数等均较野生型显著下降。遗传分析表明白化转绿和穗顶端退化表型受独立的两个隐性基因控制。控制白化转绿叶性状的Osv16定位于第3染色体RM3441和RM3029之间约125kb物理区间内,区间内未见白化转绿性状相关基因的报道。控制穗顶端退化性状的Ospaa10定位于第1染色体RM11157和RM5972之间,区间内物理距离约190kb,区间内未见穗顶端退化相关基因的报道。结论 Osv16和Ospaa10两个基因的突变导致vpa1的叶色和穗型同时出现变异,为白化转绿基因Osv16和穗顶端退化基因Ospaa10的克隆和功能研究打下了基础。     

水稻蜡质稀少突变体wax1的鉴定及基因定位

【目的】 蜡质是植物表面的一种重要保护物质,筛选和鉴定水稻蜡质相关突变体有助于解析水稻蜡质形成的遗传机制。【方法】利用EMS诱变籼稻品种湘早籼6号,从突变体库中筛选出一个蜡质稀少的突变体wax1,考查突变体的形态特征和农艺性状,利用突变体与02428杂交的F₂群体定位目标基因,并通过荧光定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】与野生型相比,wax1突变体具有叶片短小皱褶、叶表面蜡质晶体减少、穗长变短等形态特征;在农艺性状方面,突变体的株高、每穗总粒数和千粒重显著降低,但有效穗数显著高于野生型;遗传分析表明,wax1的突变表型受一对隐性核基因控制,将WAX1基因定位在第10染色体上SSR标记RM5806与InDel标记P1之间,物理距离约为49.8 kb;定位区间内的测序结果表明,突变体中β-酮脂酰-CoA合酶的编码基因发生单碱基突变,导致催化活性中心的一个氨基酸发生改变。WAX1基因的突变显著提高了同源异型盒基因OSH6的表达,同时引起部分IAA基因的差异表达。【结论】WAX1基因突变引起叶表面蜡质晶体的减少,同时通过影响茎尖分生组织和生长素的信号转导引起植株生长发育等多方面的异常。     

水稻条纹叶和白穗基因SLWP的定位及变异分析

【目的】对叶绿体发育相关基因进行克隆和功能分析,为解析叶绿体功能奠定分子基础。【方法】用甲基磺酸乙酯(EMS)处理籼稻9311获得一个条纹叶和白穗突变体slwp,通过色素分析和农艺性状观察分析该突变体的表型,通过图位克隆方法分离该基因,进一步利用定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】突变体slwp从2叶期开始至抽穗期表现出条纹叶表型,抽穗后幼穗白化,光合色素含量明显低于野生型;株高降低、抽穗延迟、产量降低等表型。该突变性状为单隐性核基因控制,该基因定位于水稻第6染色体短臂C6-4和N14标记之间0.91 Mb区间内。基因组测序表明核糖核苷二磷酸还原酶小亚基基因(RNRS1)编码区第776位点发生单碱基替换,导致甘氨酸突变为天冬氨酸;该基因与已报导的水稻基因St1、Gws和St-wp为等位基因。通过对这4个等位基因的突变位点和表型进行分析,总结了该基因不同位点突变对植株表型的影响以及籼粳之间的差异。表达分析显示与叶绿素合成有关的基因受到不同程度调控,叶绿体发育第一和第二阶段基因上调表达,光合作用相关基因均下调表达。【结论】本研究分析了SLWP(RNRS1)基因不同位点的变异对水稻表型的影响,相关结果加深了对RNRS1基因功能的认识,有助于阐明叶绿体发育的分子机制。     

水稻抽穗期基因OsDof6功能的初步研究

【目的】以前期通过穗发育芯片筛选到一个水稻Dof家族转录因子OsDof6为研究对象,进一步探究OsDof6的表达模式与生物学功能。【方法】对OsDof6的基因、蛋白及启动子序列进行生物信息学分析,利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑,通过实时定量PCR和亚细胞定位技术分析该基因的表达模式。【结果】对该基因的启动子序列分析表明,该基因启动子中存在大量与光响应、激素响应及胁迫响应相关的顺式调控元件。利用CRISPR/Cas9技术获得了2种不同突变类型的功能缺失突变体9522^Dof6-3和9522^Dof6-4。对突变体T₁株系进行表型观察发现,相较于对照,两种突变体在营养生长阶段分蘖数明显降低,转入生殖生长阶段后,两种突变体的抽穗时间推迟约3 d。实时定量PCR结果显示OsDof6在水稻根、茎、叶和穗中均有不同程度的表达,在穗发育后期相对表达量明显提高;通过亚细胞定位分析发现OsDof6定位于细胞核。【结论】初步判断OsDof6基因会影响水稻分蘖数与抽穗期。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

目的 为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。方法 以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。结果 AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变（<5bp）。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。结论 编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。     

水稻类病斑突变体lmm7的鉴定与基因定位

【目的】对水稻类病斑突变体的研究有助于解析其与植物生长和防御反应的关系。【方法】本研究在粳稻品系FI135胚培养过程中获得了1个类病斑突变体lmm7(lesion mimic mutant 7)。通过对其进行系统的表型鉴定、农艺性状考查、超微结构观察、生理学特性分析，阐明LMM7基因对植物生长的调控。通过病原菌抗性鉴定，明确lmm7对植物防御反应的影响。利用9311B与突变体lmm7杂交所得F₂群体对该突变体进行了遗传分析和基因精细定位。【结果】该突变体苗期表型正常，分蘖初期，植株基部叶片从叶尖开始不断出现褐色斑点，并向整株扩散，且斑点数目随植株生长不断增加。与野生型相比，突变体的株高、穗长、有效穗数、每穗粒数、结实率及剑叶长宽都显著降低，但籽粒性状和抽穗期没有显著性差异。遮光处理表明，突变体lmm7的表型受到光照诱导，抽穗期突变体lmm7叶肉细胞严重失绿，光合色素含量显著降低。组织化学分析表明，突变体病斑处的H₂O₂含量显著升高。透射电镜观察结果表明，突变体lmm7叶肉细胞的叶绿体数目减少，叶绿体类囊体片层结构严重受损，细胞器肿胀解体，并出现大量嗜锇小体，同时病斑内部和周围区域积累了大量的ROS。抗性鉴定结果显示突变体lmm7稻瘟病抗性水平显著高于野生型。遗传分析表明lmm7的突变表型受单个隐性基因控制。利用图位克隆的方法，目的基因被定位于水稻第7染色体短臂两InDel标记7B35和7B43之间，区间范围约260 kb。测序结果表明该区间内候选基因LOC_Os07g0203700第2891位碱基T发生了单碱基缺失，导致后续移码突变及翻译提前终止。【结论】lmm7与spl5互为等位基因，其突变抑制了植株的生长，同时增强了对稻瘟病的抗性。     

水稻顶部小穗退化性状的QTL分析

 利用水稻籼粳亚种间组合越光与桂朝2号构建的重组自交系群体,在3种环境下对水稻穗顶部小穗退化性状进行了数量性状基因座(QTL)分析。重组自交系群体中穗顶部小穗退化性状的表型均呈连续分布,表现为数量性状遗传,并出现了超亲分离。在RIL群体中共检测到6个QTL,分别位于水稻第1、2、3、5、6和7染色体上,贡献率为4.49% ~ 9.74%。其中, 在两地都分别检测到的qASA2位于第2染色体上RM3355―RM263区间;位于第1染色体标记区间RM6451―OSR13的qASA1, LOD值达3.27,其增效等位基因来自桂朝2号。     

水稻黄叶不育系突变体H08S的表型特征与遗传分析

光温敏不育系的育性因易受光温条件影响而出现波动,导致种子纯度不够,是水稻生产上常见的问题。本研究对1个水稻黄叶不育系突变体H08S进行温度敏感性分析和叶绿体超微结构观察,同时通过构建分离群体进行突变基因的遗传模式分析。结果表明,突变体H08S的表型受温度影响,为低温表达型叶色突变体,且其叶绿体结构出现异常,表现类囊体的片层结构减少,说明H08S基因的突变影响叶绿体的正常发育。突变体H08S分别与‘日本晴’、‘02428’构建F₂群体和BC₁F₁群体,观察并统计群体植株叶色表型的分离情况,并进行卡方检验,结果表明该突变性状受1对隐性单基因控制。     

水稻雌雄不育突变体Osfma2的细胞学观察及基因图位克隆

【目的】通过构建分离群体定位并克隆水稻雌雄不育基因OsFMA2,并对其在水稻育性调控中的功能进行探究。【方法】通过EMS诱变水稻宁粳4号得到稳定的不育突变体,对突变体进行表型及细胞学观察,利用精细定位和Mut-map相结合的方法克隆了水稻雌雄不育基因OsFMA2,通过实时荧光定量PCR检测其在各组织表达水平差异,利用水稻原生质体表达系统进行OsFMA2蛋白的亚细胞定位。【结果】细胞学观察发现突变体为雌雄不育。利用极端个体将其精细定位于水稻第6染色体长臂448 kb的区间内。结合全基因组重测序结果,最终确定OsFMA2为目标基因。该基因编码一个复制蛋白,在单子叶植物中高度保守。OsFMA2具有组织特异性,在幼穗中高表达。亚细胞定位结果显示OsFMA2蛋白定位于细胞核中。【结论】OsFMA2在幼穗中高表达,可能参与了水稻雄配子第一次减数分裂前期同源重组过程,同时,OsFMA2的表达对雌配子发育也产生了不利影响。     

水稻显性脆秆突变体Bc18的鉴定和基因定位

从三交组合Ⅱ-32B//协青早B/Dular的F₂群体中获得了1个脆性突变体,整个植株表现全生育期脆性。根据该突变体的表型,将其命名为Bc18(Brittle culm 18)。为了更好地鉴定该突变体,用正常茎秆强度品种中9B作轮回亲本与Bc18杂交,创制了Bc18脆秆近等基因系中脆B和中9B。表型鉴定显示,突变体Bc18在生育期、株高、单株穗数、每穗粒数、结实率和千粒重等主要农艺和产量性状上与野生型中9B 无显著差别,但茎、叶的机械强度分别下降了70.70%和47.16%。细胞壁组分分析表明,突变体Bc18茎、叶的纤维素和木质素含量与野生型中9B 无显著差异,但半纤维素含量分别提高了31.84%和17.35%。6个杂交组合F₂和12个回交BC₁F₁群体的遗传分析证明Bc18 脆性突变由单显性基因控制。采用图位克隆技术,构建了Bc18/02428和Bc18/9311的F₂定位群体,并利用网上公布的SSR标记和新设计的InDel标记,最终将Bc18基因定位在第1染色体长臂端InDel标记PBC22与PBC33之间约154 kb的区间内。     

持有Pi9基因的水稻单基因系IRBL9-W对稻瘟病菌苗期和成株期抗性差异

[目的]Pi9是一个广谱稻瘟病抗性基因,田间病圃监测发现持有Pi9的水稻单基因系IRBL9-W在苗期高抗稻瘟病,但却感穗瘟.探明水稻单基因系IRBL9-W在苗期抗病而孕穗末期感染穗颈瘟的原因,为Pi9基因在水稻抗病育种中的有效利用提供参考.[方法]利用从IRBL9-W穗颈瘟病斑上分离的8个单孢菌株以及实验室保存的单孢菌...     

水稻叶片衰老基因LPS1的克隆与功能研究

【目的】早衰突变体是研究早衰机制的良好载体,对于探究早衰的遗传机理与作用机制及提高水稻的产量和品质具有重要作用。【方法】本研究利用EMS诱变获得了一个早衰突变体lps1,并对该突变体及其野生型进行表型观察、细胞学及组织化学分析、生理生化分析、遗传分析、基因定位和激素处理。【结果】lps1的叶片从3叶期开始发黄,成熟期株高、有效分蘖数、结实率、千粒重等极显著降低。电镜观察发现lps1叶表面光滑,硅质化突起和叶绿体数目减少、片层结构紊乱。生理生化分析表明lps1中有大量的活性氧积累,同时伴有蛋白质的降解、细胞膜的损伤以及大规模的细胞死亡。遗传分析表明该早衰表型受单隐性核基因控制,并且其在第5染色体上编码了一个泛素结合酶。亚细胞定位结果证明LPS1蛋白在细胞质与核中均有表达。外源激素处理发现,lps1对外源激素的处理更为敏感,且LPS1突变促进了ABA合成相关基因的表达。【结论】LPS1 突变使水稻ABA合成信号途径异常,进而引发H₂O₂等一系列与衰老相关生理指标的异常变动,导致lps1过早衰老,最终造成水稻产量严重降低。     

水稻雄性核不育突变体ms7的遗传分析及基因定位

【目的】通过对水稻雄性不育突变体的研究,可以鉴定更多与育性或花粉发育相关的基因,有助于解析水稻雄性生殖发育的整个调控网络。【方法】常规种植条件下,突变体ms7 (male sterile 7)与对照种植于浙江富阳和海南陵水,比较它们的育性及主要农艺性状差异,利用混池关联分析和图位克隆方法进行目标基因定位。【结果】整个生育期,突变体ms7生长速率与野生型一致,成熟期的株高、分蘖数、叶数、叶大小、穗长和每穗颖花数等性状与野生型相比也没有显著差异,但ms7结实率为0,表现为完全雄性不育,花药瘦小且颜色发白,半薄切片显示绒毡层降解推迟,花粉镜检呈染败。遗传分析表明花粉败育受单个隐性基因控制,定位于第7染色体上BSA11与YD7045之间1.17 Mb的范围内。【结论】本研究为水稻雄性不育基因ms7的克隆和功能研究打下了基础。     

水稻抗性蛋白OsRRK1抗褐飞虱机理分析

目的 OsRRK1（Rop-interacting receptor-like kinase 1）蛋白是水稻中第一个被研究的类胞质受体激酶RLCKⅥ家族蛋白。在调控水稻叶片的卷曲和对褐飞虱的防御中都起着重要作用,但是其调控机理尚不清楚。本研究试图进一步探究OsRRK1基因抗褐飞虱的机理。方法 利用酵母双杂交的方法分析OsRRK1蛋白与OsLecRK（lectin-like receptor kinase）、OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3的互作关系,OsLecRK是抗褐飞虱基因BPH15区间的候选基因,是水稻先天免疫系统中一个重要成员,既参与水稻先天免疫反应,包括对褐飞虱、白叶枯病和稻瘟病的抗性,又参与水稻的发育过程。OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3的基因簇组成抗褐飞虱基因BPH3,含BPH3基因的水稻具有广谱、持久的抗虫性。同时利用DNAMAN软件分析OsLecRK蛋白与OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3的同源性。结果 DNAMAN的分析结果显示OsLecRK与OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3的同源性都很高,蛋白一致性在50%以上;酵母双杂交结果显示OsRRK1与OsLecRK、OsLecRK2和OsLecRK3互作。结论 OsRRK1通过与抗褐飞虱基因BPH15和BPH3候选基因的相互作用参与水稻抗褐飞虱过程。     

水稻黄叶早衰突变体osyes1的生理特性和基因定位

【目的】叶片是水稻进行光合作用最重要的器官。叶色突变体是研究光合作用、叶绿素合成代谢和叶绿体发育的重要材料。【方法】利用⁶⁰Co辐射诱变中籼恢复系自选1号,获得黄叶早衰突变体osyes1。幼苗期对突变体和野生型进行外源H₂O₂处理。抽穗期对突变体和野生型叶片进行超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、活性氧含量、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、叶绿素含量、净光合速率测定以及透射电镜观察。成熟期考查突变体和野生型的主要农艺性状。以osyes1/02428的F₂群体中的隐性单株为作图群体,利用图位克隆方法定位OsYES1基因。【结果】osyes1的突变性状始于3~4叶期,水稻抽穗后,所有叶片均表现为黄叶衰老症状,致使突变体株高、穗长、每穗粒数及结实率极显著低于野生型对照。与野生型对照相比,突变体幼苗对外源H₂O₂更敏感。生理分析表明,孕穗期野生型倒3叶的叶绿素含量、过氧化物酶和过氧化氢酶活性极显著低于倒2叶和剑叶,而突变体的含量则极显著低于野生型且依次极显著降低;与野生型相比,突变体剑叶、倒2叶和倒3叶的丙二醛、H₂O₂和O₂^-含量极显著增加,而可溶性蛋白含量则相反。遗传分析表明,osyes1受一对隐性核基因控制,利用图位克隆技术将OsYES1基因定位于第7染色体短臂的RM21353与RM21384之间,物理距离为708 kb。【结论】由于osyes1叶片过早黄化衰老导致与产量相关的重要农艺性状显著下降。OsYES1基因定位在第7染色体两个SSR标记(RM21353和RM21384)之间的708 kb的物理区间内。