西沙海绵共附生放线菌ITBB-ZK-a5的分离鉴定及抗菌活性研究

海洋放线菌因其所处环境特殊，在生理性状和遗传背景方面均具有独特的性质，因此海洋放线菌具有产生特殊代谢产物的巨大潜力。本研究以西沙海绵为研究对象，挖掘其具有抑菌活性的共附生放线菌资源。首先，利用平板分离法从海绵样品中分离纯化出一株活性放线菌菌株ITBB-ZK-a5，对其进行16S rRNA基因测序，结合构建的系统发育树和菌落形态特征，确定该菌株为链霉菌。其次，采用平板对峙法研究菌株ITBB-ZK-a5对植物病原真菌的抑菌广谱性和持效性。结果表明：该菌株对供试的16株病原真菌均有较好的抑菌活性，抑菌谱较广，且对峙14、30 d仍具有活性，抑菌持效性较好；为了进一步验证该菌株平板通过产生活性物质抑制病原菌生长，对菌落边缘的无菌琼脂块进行抑菌活性研究，结果表明抑菌率与菌落距离呈负相关，说明放线菌可能通过向平板中分泌活性物质以抑制病原菌的生长。该菌株连续转接5代后，仍具有较好的世代稳定性。再次，利用大米固体培养基对菌株ITBB-ZK-a5进行发酵，乙酸乙酯萃取浓缩得到提取物，通过滤纸片法对发酵粗提物进行光稳定性和热稳定性研究，结果表明，随着水浴温度升高和紫外照射时间的增加，菌株ITBB-ZK-a...     

红树共附生微生物分离与抗白色念珠菌活性评价

对湛江市廉江高桥、东简北港2个红树林区红树的根、叶、花、果不同部位27份样品进行共附生微生物的分离及抗白色念珠菌活性的评价。采用改良M1培养基、改良马丁培养基和改良高氏一号培养基进行细菌、真菌和放线菌的分离,用美蓝酶标仪法对所筛菌株进行抗白色念珠菌活性评价。利用SPSS13.0软件对数据进行单因素方差分析和多重比较。从27份样品中共分离出384株红树林共附生微生物,其中细菌170株,真菌160株,放线菌54株,细菌和真菌为优势菌群,两者占分离总菌株数的86.0%;从384株分离菌中检测出64株具有抗白色念珠菌活性,占分离菌的16.7%;统计分析显示,除2个地区的抗白色念珠菌活性数无显著差异外,2个地区的红树共附生微生物的组成、不同类型共附生微生物的数量、不同类型共附生微生物的抗白色念珠菌活性、红树不同部位的共附生微生物数量与活性菌株数量均存在一定的差异。     

茶园土壤高活性氨化菌的筛选鉴定及特性研究

经过菌株富集培养、分离纯化等一系列步骤,从山东茶园土壤中分离出33株氨化细菌菌株。经过活性比较和菌株分类,从中选出3株不同种属的高活性菌株。通过对其进行形态特征、生理生化指标的测定及16 S rDNA测序,初步鉴定菌株SNT3属于芽孢杆菌属,菌株SNT6属于微小杆菌属,菌株SNT33属于不动杆菌属。同时对菌株的生长环境以及氨化活性进行了初步研究。结果表明:菌株SNT3、SNT6和SNT33适宜的pH依次为5～8.5、6～8.5、5～7;3株菌株的最适宜生长温度为35℃;在氨化能力方面,菌株SNT3高于菌株SNT6、SNT33。     

莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中可培养芽胞杆菌资源遗传多样性研究

采用80℃水浴处理与稀释涂布法从莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中分离获得215株芽胞杆菌。采用16S rDNA PCR-RFLP与16S rDNA序列分析技术,对分离的菌株进行遗传多样性分析。16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱UPGMA聚类分析结果表明,在100%的相似性水平上,分离菌株归属到9种酶切类型。16S rDNA测序结果显示,这些菌株主要分布在Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等4个属,其中Pontibacillus为优势属。有7株芽胞杆菌的16S rDNA序列与数据库中相应模式菌的最大相似性在97.4%~99.0%之间,有可能为芽胞杆菌新种资源。     

一株拮抗香蕉枯萎病菌的细菌HN-1的鉴定和拮抗作用的测定

在香蕉枯萎病园区中,从土壤中分离获得一株细菌HN-1,并进行对峙培养、孢子萌发抑制测定。结果表明：HN-1对香蕉枯萎病菌的菌丝生长、孢子萌发具有良好的抑制效果。经形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列测定和分析,将HN-1鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌株对供试的15种植物病原真菌均有很好的抑制作用。     

不同产区青稞根部可培养内生固氮菌的多样性研究

为认识青稞内生固氮菌群落组成,丰富内生固氮菌资源,明确产地对青稞内生固氮菌多样性的影响,本研究利用纯培养技术分别对在拉萨、林芝、日喀则栽培的藏青2000根部内生固氮菌进行分离、纯化,并测定各菌株的固氮酶活性及高固氮酶活性菌株的溶磷、溶钾及产IAA特性,最后,通过16SrDNA基因测序和构建系统发育树研究了高固氮酶活性菌株的分类学地位。结果显示,通过Ashby培养基分离、纯化得到内生固氮菌37株,其中,具有高固氮酶活性的11株,占总分离菌株27%,有6株菌株具有分泌IAA的能力,2株具有溶钾能力,1株具有溶磷能力。16S rDNA测序结果表明,11株高固氮酶活性的菌中,有5株菌属于Bacillus,为优势菌属,其余菌株分别属于Gemmatimonas、Sphingomonas、Devosia、Agrobacterium、Mesorhizobium和Burkholderia。     

传统豆制品白干与薄百叶中优势腐败菌的分离与初步鉴定

以传统豆制品白干和薄百叶为材料,对贮藏过程中主要腐败微生物进行分离鉴定。利用纯培养的方法共筛选出菌落形态差别比较明显的菌株19株。对细菌菌株进行形态观察、革兰氏染色和生理生化鉴定,同时对细菌和酵母菌纯培养物提取DNA,分别进行16S rDNA和26S rDNA PCR扩增,PCR产物经测序后与NCBI中已知序列进行比对和鉴定,确定各细菌和酵母菌菌株的种属;霉菌纯培养物染色后观察孢子繁殖形态,最终确定这些菌株的种属。结果表明:白干和薄百叶中共有的优势腐败菌是溶酪葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,约翰逊不动杆菌,戊糖片球菌;季也蒙毕赤酵母,皮状丝孢酵母;圆弧青霉和黄绿青霉。此外,白干中还有诞沫假丝酵母;薄百叶中有浅黄假单胞菌,芸苔丝孢酵母。     

2株依赖海水细菌的分离培养和鉴定

为提高海洋微生物的可培养性,采用海水需求实验分离海洋细菌的方法,分离出9株严格依赖海水生长的细菌。通过16S rDNA测序及同源性分析发现：菌株HB10001(＝CGMCC 1.10781T)与Spongiibacter tropicus DSM19543T的16S rDNA序列同源性最高,为96.3%,其(G＋C)含量为66.7 mol%;菌株HB10303与Paenibacillus. agaridevorans DSM1355T的16S rDNA序列同源性最高,为98.4%,其(G＋C)含量为45.5 mol%。     

海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及其抗热带作物病原真菌活性研究

白蚁（Isoptera）的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行,所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此,白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系,放线菌是其中一个重要的类群,且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。但是白蚁共附生放线菌能否对热带作物的病原真菌有抑制活性有待研究。为了挖掘在热带农业绿色健康发展中具有应用潜力的海南特色农用放线菌资源,以海南白蚁共生放线菌为研究对象,利用平板分离法从采集的健康白蚁体内分离纯化放线菌,利用平板对峙法筛选生防菌株;通过分子生物学确定其分类地位;平板对峙法研究拮抗菌株的抗菌稳定性、持效性和广谱性;滤纸片法研究抑菌物质的热稳定性。结果从海南白蚁体内分离得到1株拮抗活性较好的放线菌菌株W7,系统发育树分析结果表明该放线菌与链霉菌属（Streptomyces）亲缘关系接近。菌株W7的抗菌活性持久性强,平板接种30 d后仍对植物病原真菌具有抑菌活性,抗菌稳定性好;菌株W7抑菌谱广,对16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性,其中对芒果胶孢霉（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、香蕉炭疽霉（Colletotrichum musae）、辣椒棒孢霉（Corynespora cassiicola）、豇豆瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp]抑制作用较强,对芦笋拟茎点霉（Phomopsis asparagi）、荔枝疫霉（Peronophythora litchi）抑制作用较弱;菌株W7发酵粗提物有较好的热稳定性,但是抑菌率会随着水浴温度的增高而降低。本文首次对海南白蚁共附生放线菌进行了分离鉴定,并从中筛选得到1株具有抑制多种热带作物病原真菌活性的生防菌株,为高效生防菌剂的研发提供新资源。     

拮抗炭疽病的茶树内生菌筛选、鉴定及培养条件优化

为筛选高效拮抗茶树炭疽病的内生细菌,以茶树健康叶片为材料,采用平板对峙拮抗法进行筛选,并对筛选到的菌株进行鉴定、抑菌效果评价及培养条件优化。从分离的162株内生细菌中筛选到1株对茶树胶孢炭疽菌有较好抑制效果的拮抗细菌X13。形态学、生理生化鉴定及16 S rDNA系统进化发育分析显示,分离的菌株X13为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。菌株X13对病原菌菌丝生长抑制率为61.6%。生长曲线表明,菌株X13对数生长期为接种后2～14 h。响应面优化的培养条件为4.0%（质量百分浓度）玉米粉,1.0%（质量百分浓度）的硝酸钠,接种量3.5%（体积分数）。本研究结果可为茶树炭疽病防治及生防菌剂的开发提供重要参考。     

硅对甘蔗黑穗病菌的体外抑菌效果研究

由鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的黑穗病是甘蔗（Saccharum spp.）生产上最重要的真菌病害。硅是植物生长过程中的有益矿质元素,能够提高植物对生物和非生物胁迫的抗性。目前,关于外源硅对甘蔗黑穗病菌的体外抑菌作用尚未见报道。本研究以硅酸钠（sodium silicate, Na₂SiO₃）和硅酸钾（potassium silicate, K₂SiO₃）处理甘蔗黑穗病菌,观察黑穗病菌的孢子萌发、菌落直径和菌丝生长情况,评价不同硅剂和pH对甘蔗黑穗病菌的体外抑菌效果。结果显示,0.5~20.0 mmol/L Na₂SiO₃和K₂SiO₃均完全抑制甘蔗黑穗病菌的孢子萌发,但1.0 mmol/L Na₂SiO₃促进甘蔗黑穗病菌菌落和菌丝的生长,10.0、20.0 mmol/L Na₂SiO₃和K₂SiO₃则显著抑制菌落和菌丝的生长,表明Na₂SiO₃和K₂SiO₃均会影响甘蔗黑穗病菌的生长,高浓度Na₂SiO₃和K₂SiO₃的抑菌效果明显。在不同pH条件下,低pH（5.87~10.86）处理下的甘蔗黑穗病菌孢子有萌发,但其萌发率随着pH的增大逐渐降低,高pH（≥10.96）完全抑制孢子萌发,此外,pH为9.40和11.57对菌落直径的抑制效果明显。调整pH为6.0的低浓度Na₂SiO₃（0~5.0 mmol/L）和K₂SiO₃（0~3.5 mmol/L）对孢子萌发影响小,但pH为6.0的高浓度Na₂SiO₃（7.0~20.0 mmol/L）和K₂SiO₃（5.0~20.0 mmol/L）显著抑制孢子萌发,表明相同pH水平下的K₂SiO₃比Na₂SiO₃及其对应pH处理对甘蔗黑穗病菌孢子萌发的抑制作用更为明显。研究结果为外源硅在甘蔗抗黑穗病的药效试验和防治机理研究提供参考。     

促生细菌Bacillus sp. QN2MO-1的鉴定及对番茄生长的影响

为分离和鉴定具有促生作用的内生菌,开发潜在功能的微生物菌株,本研究以诺尼（Morinda citrifolia L.）为研究对象,从植株不同组织中共分离得到621株内生细菌,经复筛得到具有促生和解磷作用的菌株,命名为QN₂MO-1。基于菌株的生理生化分析和16S rDNA的序列比对,该内生细菌与Bacillus siamensis KCTC 13613^T（AJVF01000043）具有99.04%的同源性。药敏性分析显示,该菌对青霉素、硫酸链霉素和氨苄西林具有明显的抗性。QN₂MO-1可促进番茄种子的萌发;与对照相比,5%菌体发酵液处理能显著提高植株的生长。     

甘蔗内生菌分离鉴定及功能多样性研究

为探究甘蔗内生菌多样性组成及相关特性,本研究采用稀释涂板法分离并结合形态观察和分子标记(gyrB,rpoB, ITS, 16S rDNA)进行鉴定。结果表明,从12个栽培品种(系)和5个野生种无性系的根、茎、叶组织中共分离到细菌589株、放线菌34株和真菌46株;细菌中固氮菌有41株,溶磷菌有98株,解钾菌有52株,对黄曲霉和禾谷镰刀菌具有拮抗作用分别有44株和35株。内生细菌分属21个属,其中芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属和泛菌属为优势属;内生真菌分属于枝顶孢属、链格孢属、曲霉属、镰刀菌属、枝孢属等17个属,而放线菌仅为链霉菌属。具有潜在植物益生功能的菌株主要集中在芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、类芽孢杆菌属及泛菌属。本研究显示甘蔗栽培品种(系)和野生种无性系均含有丰富的内生菌资源,且栽培品种(系)所含内生菌在数量和多样性上均高于野生种无性系;12个栽培品种(系)间所分离到的内生细菌大部分相同,但也存在差异。通过初步的功能鉴定,筛选出一些具有应用潜力的益生微生物,为开发相应功能的生物菌剂奠定基础。     

云南省田菁根瘤菌及根瘤内生细菌遗传多样性研究

本研究采用BOX-PCR指纹图谱和16SrDNA全序列分析,对45株分离自田菁的根瘤菌及根瘤内生细菌进行了菌株多样性研究,BOX-PCR指纹图谱分析结果表明,在78%的相似性水平上,待测菌株分成了4个遗传群,其中群Ⅰ和群Ⅳ分别与根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和大肠杆菌(Escherichia coli)聚在一起,其它群没有与参比菌株聚群。选取每群的代表菌株进行16SrDNA全序列测定。结果表明:待测菌株归于6个属,分别是贪铜菌属(Cupriavidus)、拜纳蒙纳斯属(Balneimonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、克罗诺杆菌(Cronobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)和泛菌属(Pantoea),菌株表现了丰富的遗传多样性;其中分离自田菁的根瘤菌隶属于贪铜菌属(Cupriavidus)和拜纳蒙纳斯属(Balneimonas)尚未见其它文章报道。     

钝叶草叶斑病病原鉴定

为鉴定钝叶草叶斑病的病原,通过对61份来自中国海南、广东、广西、云南、福建、江苏,以及美国和南非的疑似钝叶草叶斑病的叶片样品进行分离培养,获得120个菌株,对其进行纯化培养、形态学观察、致病性测定,利用来自海南的钝叶草为靶标寄主,并利用rDNA-ITS、GAPDH、TUB2引物对55号菌株进行分析鉴定。结果表明,经柯赫氏法则验证40株菌株不致病,70株致病性较弱,10株致病性强;选择55号致病性强菌株,进行形态观察,初步确定该病的病原菌为新月弯孢霉（Culvularia lunata）,经3种引物的PCR扩增测序鉴定,和C. lunata相似性达到99%,进一步确定钝叶草叶斑病的致病菌为新月弯孢霉。研究结果将为今后对钝叶草叶斑病的发病规律、防治方法及抗病机制等方面的研究提供理论依据。     

二步发酵法在西番莲果皮酵素加工中的应用

以西番莲果皮为对象,研究酿酒酵母菌、乳酸菌二步发酵工艺,制备乳酸菌和酿酒酵母菌活菌数高、多酚保留好、风味醇和的果皮浆。通过单因素和正交优化实验,以酿酒酵母菌和乳酸菌活菌数、总酚、乙醇生成量为指标,分别优选了单一乳酸菌和酿酒酵母菌发酵的工艺参数,在此基础上,通过测定总酸含量、活菌数、总酚含量等指标的变化,确定二步法发酵西番莲果皮浆的工艺参数为：发酵总时间40 h,酿酒酵母菌初始接种量1.5%,在29 ℃下发酵16 h后,再接入2.0%复合乳杆菌（干酪乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1）,在37 ℃下继续发酵24 h至终点。制备的西番莲果皮发酵液中,复合乳杆菌活菌数为8.93 lg CFU/mL,酿酒酵母菌活菌数为7.78 lg CFU/mL,总酚含量为24.00 μg/mL,总酸含量为4.40 mg/mL。二步发酵法发挥了酿酒酵母菌产香、产乙醇抑制杂菌,以及乳酸菌提高酸度、保留多酚物质的优点。     

硫藤黄链霉菌St-79对水稻白叶枯病的防效和促生作用

【目的】水稻白叶枯病是水稻的主要细菌性病害之一,严重影响水稻生产。本研究获得一株有效防治水稻白叶枯病的放线菌菌株,探索其对白叶枯病的防效和促进水稻生长的作用,为生防菌的开发利用提供科学依据。【方法】利用梯度稀释涂布法、共培养法和牛津杯法筛选拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)的放线菌菌株;通过形态特征、生理生化反应、16Sr DNA序列和系统发育树分析对其进行分类鉴定;利用共培养法分析目标菌株的抗菌谱;通过96孔板微量稀释法、扫描电子显微镜、微生物粘附碳氢化合物法等探究目标菌株的抑菌作用;通过发酵滤液浸种与菌液喷洒土壤的方法探究其对水稻生长的促进作用;利用盆栽试验探索目标菌株发酵滤液对水稻白叶枯病的防治效果。【结果】从不同生境土壤中分离出140株放线菌菌株,最终筛选得到一株对Xoo具有强拮抗活性的放线菌菌株St-79,其发酵滤液抑菌圈直径为64mm,并鉴定其为硫藤黄链霉菌(Streptomycesthioluteus)。菌株St-79对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)、大豆细菌性斑疹病菌(Xa...     

甘蔗黑穗病的防治药剂筛选及产量评价

由甘蔗鞭黑粉菌引起的甘蔗黑穗病是我国甘蔗生产中危害最大的病害,给甘蔗产业造成严重的产量和经济损失。化学防治是作物病害综合防治的重要措施之一,开展甘蔗黑穗病高效、低毒、低残留防治药剂的筛选,进行田间防治试验,对甘蔗黑穗病的有效防治和提高甘蔗产量具有重要意义。为筛选适合大田防治甘蔗黑穗病的推荐化学药剂,通过测定11种杀菌剂对甘蔗鞭黑粉菌的抑菌试验,采用扫描电镜解析有效杀菌剂的抑菌机理,通过新植蔗和宿根蔗的甘蔗黑穗病大田防治试验,评价杀菌剂的防治效果和对产量、株高、茎径、公顷有效茎数、锤度、单茎重等甘蔗主要农艺性状的影响。结果表明,经室内生物活性测定,获得4种杀菌剂对甘蔗鞭黑粉菌单倍体生长、有性配合、冬孢子萌发有抑制作用,分别是42.4%唑醚·氟酰胺悬浮剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、250 g/L吡唑醚菌酯乳油和325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂。扫描电镜显示,这4种杀菌剂均对甘蔗鞭黑粉菌冬孢子和单倍体孢子细胞组织造成不同程度的破坏,使甘蔗鞭黑粉菌失活。在大田新植蔗的甘蔗黑穗病防治试验中,42.4%唑醚·氟酰胺悬浮剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、250 g/L吡唑醚菌酯乳油和325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂的防治效果分别为91.81%、82.84%、81.76%、70.92%,各药剂防治区产量分别比对照增产20.84%、17.13%、15.92%、13.35%。在宿根蔗的甘蔗黑穗病防治试验中,以上杀菌剂防治效果分别为89.35%、82.21%、81.51%、70.18%,其产量分别比对照增产30.15%、24.05%、20.33%、16.58%。新植蔗和宿根蔗药剂防治区的甘蔗其他农艺性状均优于对照区。这4种杀菌剂对甘蔗黑穗病均有良好的防治效果和增产作用,可作为大田防治甘蔗黑穗病的推荐杀菌剂。     

不同品系昆虫病原线虫对蜂巢小甲虫的致病力研究

为明确市售昆虫病原线虫制剂对蜂巢小甲虫（Aethina tumida）幼虫和蛹的致病力,为该害虫的防治提供新的技术措施,室内采用浸渍法、土壤法测定了5种不同品系昆虫病原线虫对蜂巢小甲虫末龄老熟幼虫和蛹的致病力,采用土壤法测定了小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocapsae All）不同施用时间、不同施用剂量对蜂巢小甲虫幼虫致病力的影响。浸渍法生物测定结果表明,5种不同品系昆虫病原线虫对蜂巢小甲虫幼虫的致病力差异很大,其中小卷蛾斯氏线虫All侵染4 d、12 d后,蜂巢小甲虫幼虫的校正死亡率分别为67.50%±0.05%和72.36%±3.14%,均显著高于其他品系。土壤法生物测定结果表明,昆虫病原线虫对蜂巢小甲虫幼虫具有明显的致死作用,其中小卷蛾斯氏线虫All对蜂巢小甲虫幼虫的侵染效果达100%,显著高于其他线虫品系。蜂巢小甲虫幼虫入土后,按不同时间顺序施用小卷蛾斯氏线虫All,结果表明14 d前施用均能取得良好的防治效果。侵染期线虫小卷蛾斯氏线虫All与蜂巢小甲虫幼虫数量之比大于213∶1时,防治效果最佳。因此小卷蛾斯氏线虫All具有防治蜂巢小甲虫的潜力,可在发生蜂巢小甲虫危害的蜂场推荐使用。