牡丹转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用Misa软件对牡丹转录组数据进行SSR信息分析和分子标记开发,并通过PCR扩增进行引物多态性分析。结果显示,对牡丹转录组测序获得的131 265条Unigene进行筛选,共获得44 181个SSR位点,分布于38 316条Unigene中,SSR的发生频率和平均分布距离分别为29.19%和2.23 kb。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,分别占SSR总数的75.19%、15.02%和6.88%。依据转录组中的SSR信息序列,随机合成60对引物在16份牡丹品种中进行多态性扩增,其中15对引物表现出多态性,各个位点的等位基因数为4～13个,平均等位基因数8.13个,观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)、香农多样性指数(I)、多态信息含量(PIC)的平均值分别是0.757 8、0.790 3、1.718 6和0.730 8。     

火龙果转录组SSR的信息分析及其分子标记开发

为火龙果种质资源的遗传多样性评价及品种分子鉴定提供参考,利用MISA软件对获得的Unigene进行筛选,以确定火龙果转录组的SSR位点及分布,进而利用Primer 3.0软件设计SSR引物,并利用PCR扩增筛选SSR多态性引物,根据SSR扩增产物的多态性,利用UPGMA方法对15个火龙果种质材料进行聚类分析。结果表明:在碱基序列总长度为54.975Mb的79 658条Unigene中,筛选得到16 523个SSR位点,分布于13 493条Unigene序列上,SSR位点的出现频率为20.74%,平均每3.33kb出现1个SSR位点;SSR的主要类型是单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复,其占比分别为59.58%、26.53%和12.93%;随机筛选获得的37对引物经PCR扩增,有23对引物可扩增出清晰条带,11对引物在15个火龙果种质材料中表现出多态性;UPGMA聚类分析将15个火龙果种质材料分为4类,其中,果肉为紫红色或粉红色的贵州紫红龙、贵州红肉-1和台湾红水晶等8个火龙果种质材料聚为Ⅰ类,果肉为红色或粉红色的贵州红龙、云南红肉-2和云南粉肉3个种质材料聚为Ⅱ类,果肉为白色的云南白肉-1、云南白肉-2和贵州野生白肉3个种质材料聚为Ⅲ类,果肉为紫红色的台湾黑龙火龙果种质材料单独为Ⅳ类。     

油棕转录组SSR 标记开发研究

从NCBI网站下载4072 条油棕EST,结合文献报道的油棕果肉转录组序列信息,通过聚类拼接和处理,得到全长为32637.947 kb的无冗余序列20054条。在这些序列中共检索出4 538 个SSR袁检出率为22.6%遥其中以单核苷酸重复基序为主导类型袁出现频率为51.2%,二核苷酸、三核苷酸重复基序的出现频率分别为20.4%和17.9%。随机挑选了400对SSR引物进行PCR 多态性检测,获得29对PCR多态性引物,并随机选取11引物进行验证,在4种不同来源的油棕样本中表现出多态性。     

罗氏沼虾转录组SSR标记信息分析

对罗氏沼虾肝胰腺组织转录组测序获得的33 450条Unigenes,进行简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)检测与分析。结果共检测出15 356个SSR位点,分布在12 930条Unigenes上,发生频率为38.65%,平均距离为1.91 kb。其中,优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸。SSR序列重复长度主要为12～16 bp和18 bp,占罗氏沼虾总SSR的86.33%。单核苷酸重复基序中多数为A/T,二核苷酸重复基序以GA/TC、AG/CT及AT/TA为主,三核苷酸重复基序主要为AAT/TTA、AAG/TTC、ATT/TAA、CCT/GGA、CTC/GAG和CTT/GAA。最后,对SSR所在的Unigene进行了KOG分类注释。通过对罗氏沼虾转录组SSR位点信息分析,获得多态性较为丰富的SSR位点,具有极大的开发价值,可为罗氏沼虾遗传多样性的分析、遗传图谱的构建及分子标记辅助育种提供有效工具。     

黑果枸杞转录组SSR信息分析及分子标记开发

分析黑果枸杞Lycium ruthenicum转录组中简单重复序列（SSR）位点信息,开发SSR分子标记。采用MISA软件在黑果枸杞转录组中共检测到73 896个SSR位点,分布于56 170条单基因簇（unigenes）中,出现频率为26.36%,平均分布距离为3.55 kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的74.33%,13.30%和11.81%;共发现84种重复基序,重复次数为5~33次,其中出现频率最高的基序为A/T,AG/CT,AT/AT,C/G和AAC/GTT。针对SSR位点设计了12 674对引物,随机挑选128对引物进行多态性验证,其中74对（57.8%）得到清晰的扩增产物;用其中的28对高多态性引物对24份枸杞种质进行扩增,共检测到等位基因256个,平均为9.1个。平均主效等位基因频率、观察杂合度、期望杂合度和多态信息量分别为0.432,0.439,0.712和0.678。以上结果表明:基于黑果枸杞转录组测序得到的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,获得的大批量SSR标记可为枸杞遗传多样性分析和遗传图谱构建提供可靠的标记选择。     

雄性不育东方百合转录组SSR信息分析及其分子标记开发

【目的】对东方百合雄性不育系开展转录组测序分析,开发SSR分子标记,为东方百合雄性不育系遗传多样性研究奠定基础。【方法】利用MISA软件对筛选得到的1 Kb以上的Unigene做SSR分析,利用Primer3.0设计引物,随机选择71对引物进行多态性扩增。【结果】共获得135 483条Unigene,筛选得到12 391个SSR位点(占总Unigene的9.15%);其中SSR位点中主导类型为单核苷酸重复,占总SSR的63.94%;其次是二核苷酸重复,其出现频率为20.65%。通过Primer3.0设计得到11 948对SSR引物,随机选择71对SSR引物对24种不同来源的东方百合可育品种及雄性不育系进行多态性验证分析,结果显示在22对可扩增产物的SSR引物中,引物表现稳定可重复的多态性,各个位点的等位基因介于3～8个,平均等位基因数5个,多态信息含量PIC平均值0.5048、观测杂合度Ho平均值0.1977、期望杂合度He平均值0.4533。【结论】研究表明通过对东方百合雄性不育系转录组分析可获得较高频率的SSR位点且类型丰富,为东方百合雄性不育系遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了候选标记。     

基于转录组测序开发糜子SSR标记

【目的】以6份不同地理来源的糜子资源为试验材料,基于前期转录组测序获得的1 000对SSR引物,选出200对进行多态性检测,以期构建一批可以准确评估糜子种质遗传差异的分子标记。【方法】用Primer Premier5.0软件设计引物,改良CTAB法提取DNA,PCR扩增DNA和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选引物多态性;用PowerMarker3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数。【结果】200对引物中97对呈单态性,80对呈多态性。单碱基序列重复引物有20对,10对具多态性,其重复基元是A(50%)和T(50%)。二碱基序列重复引物有36对,15对具多态性,其碱基重复类型有7种(AG最多,TC、GC和GA次之,CA、TA和AC最少)。三碱基序列重复引物有144对,55对具多态性,其碱基重复类型有24种(GGC、GCG和GCC最多,GAA、GCT和CGC等次之,ACC、AGG、CAG、CGT、AAG、AAC、TCG、CGA、ATT、CAA和CCA最少)。就引物分辨率(Rp)值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.67—4.67(平均2.07)、1.33—4.33(平均2.73)和0.67—4.00(平均1.83)。基于Rp值分析SSR分布频次,发现80个标记分布在5个区间:0—1、1—2、2—3、3—4和4—5,分别包含17(21.25%)、36(45.00%)、11(13.75%)、14(17.50%)和2个(2.50%)。就■而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.33—0.67(平均0.51)、0.40—0.78(平均0.59)和0.33—0.83(平均0.59)。单碱基序列重复标记共检测到22个等位变异,每个位点为2—3个(平均2.2000),其中8个和2个位点分别具2和3个变异;二碱基序列重复标记共检测到38个等位变异,每个位点为2—3个(平均2.5333),其中7个和8个位点分别具2和3个变异;三碱基重复标记共检测到136个等位变异,每个位点为2—3个(平均2.4727),其中29个和26个位点分别具2和3个变异。就多态性信息含量而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.3750—0.5355(平均0.4293)、0.2392—0.7438(平均0.4293)和0.2392—0.7438(平均0.3989)。就多样性指数而言,1—3碱基序列重复分别为0.6365—1.0776(平均0.7497)、0.5623—1.0986(平均0.8339)和0.5623—1.0889(平均0.8312)。【结论】基于转录组测序结果,检测200对SSR引物的多态性,发现177对(88.5%)可以扩增出完整条带,其中80对具多态性,多态率为40%。     

基于转录组测序开发糜子SSR标记

【目的】以6份不同地理来源的糜子资源为试验材料,基于前期转录组测序获得的1 000对SSR引物,选出200对进行多态性检测,以期构建一批可以准确评估糜子种质遗传差异的分子标记。【方法】用Primer Premier5.0软件设计引物,改良CTAB法提取DNA,PCR扩增DNA和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选引物多态性;用PowerMarker3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数。【结果】200对引物中97对呈单态性,80对呈多态性。单碱基序列重复引物有20对,10对具多态性,其重复基元是A(50%)和T(50%)。二碱基序列重复引物有36对,15对具多态性,其碱基重复类型有7种(AG最多,TC、GC和GA次之,CA、TA和AC最少)。三碱基序列重复引物有144对,55对具多态性,其碱基重复类型有24种(GGC、GCG和GCC最多,GAA、GCT和CGC等次之,ACC、AGG、CAG、CGT、AAG、AAC、TCG、CGA、ATT、CAA和CCA最少)。就引物分辨率(Rp)值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.67—4.67(平均2.07)、1.33—4.33(平均2.73)和0...     

花椰菜转录组SSR位点分析及其分子标记开发

【目的】开发适合花椰菜的SSR分子标记,为花椰菜品种遗传关系鉴定、遗传图谱绘制等提供候选标记。【方法】以24份花椰菜材料为研究对象,通过MISA软件对其转录组SSR位点信息进行分析,设计SSR引物,对这些引物进行PCR扩增,开发高多态性花椰菜的SSR分子标记;利用差异条带对不同花椰菜材料的亲缘关系进行分析。【结果】从转录组数据中得到66 450条Unigene基因,包含10 715个SSR位点,发生频率为12.09%,平均分布距离为5.9 kb。SSR位点中优势类型为二核苷酸重复基序,出现频率占总SSR的51.16%;其次是三核苷酸,占总SSR的47.37%。重复序列基序共49种,其中出现频率较高的重复基序主要为AG/CT、GA/TC和AAG/CTT。有1 164个长度≥20 bp的SSR位点,获得具有潜在高多态性的SSR引物6 119对。随机设计的40对引物中有31对引物能进行有效扩增,其中有17对引物在24份花椰菜品种中表现出多态性。UPGMA分析显示,在遗传距离为0.625时,17对多态性引物可将24份花椰菜分为3类。【结论】开发的花椰菜SSR标记类型丰富,出现频率高,具有较高的可用性。     

花椰菜转录组SSR位点分析及其分子标记开发

【目的】开发适合花椰菜的SSR分子标记,为花椰菜品种遗传关系鉴定、遗传图谱绘制等提供候选标记。【方法】以24份花椰菜材料为研究对象,通过MISA软件对其转录组SSR位点信息进行分析,设计SSR引物,对这些引物进行PCR扩增,开发高多态性花椰菜的SSR分子标记;利用差异条带对不同花椰菜材料的亲缘关系进行分析。【结果】从转录组数据中得到66 450条Unigene基因,包含10 715个SSR位点,发生频率为12.09%,平均分布距离为5.9kb。SSR位点中优势类型为二核苷酸重复基序,出现频率占总SSR的51.16%;其次是三核苷酸,占总SSR的47.37%。重复序列基序共49种,其中出现频率较高的重复基序主要为AG/CT、GA/TC和AAG/CTT。有1 164个长度≥20bp的SSR位点,获得具有潜在高多态性的SSR引物6 119对。随机设计的40对引物中有31对引物能进行有效扩增,其中有17对引物在24份花椰菜品种中表现出多态性。UPGMA分析显示,在遗传距离为0.625时,17对多态性引物可将24份花椰菜分为3类。【结论】开发的花椰菜SSR标记类型丰富,出现频率高,具有较高的可用性。     

文冠果转录组SSR特征分析及EST-SSR标记开发

【目的】利用高通量测序技术分析文冠果转录组中SSR位点分布类型与特征,并设计开发EST-SSR标记,为文冠果的遗传多样性分析提供标记资源。【方法】利用MISA软件筛选文冠果51 867条unigenes中的SSR(2~6bp)位点,统计分析SSR位点的分布特征、发生频率和平均分布距离。利用Prime 3在线软件随机设计合成60对EST-SSR标记,用我国7个省份的16份文冠果材料对所设计的标记进行多态性筛选;用Popgene 32软件分析标记的等位基因数(NA)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)和多态性信息含量(PIC)等。【结果】从文冠果unigenes中筛选出6 707个SSR位点,其平均发生频率为12.93%,平均分布距离5.38kb,平均长度17.30bp,其中2、3核苷酸重复单元的发生频率分别为6.24%和4.93%。设计的60对标记中有47对能扩增出与目的片段长短相符的产物,其中14对多态性较高,共扩增到52个等位基因,HO和HE分别为0~0.813和0.353~0.762,PIC为0.283~0.701。【结论】文冠果转录组SSR重复单元以2、3核苷酸重复为主;新开发的14个EST-SSR标记可作为文冠果种质资源多样性分析的标记资源。     

基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析

【目的】开发基于山茶转录组的EST-SSR分子标记,并应用该标记进行山茶种质的亲缘关系分析。【方法】本研究以山茶叶片转录组测序所获得的50 518条Unigenes为背景数据,利用MISA软件搜索SSR标记,设计并筛选SSR多态性引物,对8份山茶种质进行了UPGMA聚类。【结果】共检索到13 197个SSR位点,SSR的发生频率和分布频率分别为19.52%、26.12%,平均分布距离为4.33 kb;在6种SSR重复类型中,以单、二、三核苷酸这3种重复类型为主,分别占48.420%、34.917%和15.473%;出现频率高的基序类型为A/T、AG/CT和AT/TA,占总SSR位点的79.61%;三核苷酸中以AAG/CTT、ACC/GGT、AAT/ATT类型居多;在设计出的10 974对引物中,随机选用其中90对引物进行多态筛选,73对引物扩增产物与预期大小一致,有效扩增率为81.11%,29对引物存在扩增多态性,占39.73%。扩增得到72个等位基因,有效等位基因数平均达到3.264;观察杂合度和期望杂合度的平均值分别为0.208和0.638,引物多态信息含量平均为0.496;8份山茶种质在相似系数为0.58时,可以分为4类:山茶原种为Ⅰ类,‘黑蛋石’、‘红叶黑魔法’和‘黑骑士’为Ⅱ类,‘黑魔法’和‘金华美女’分别为Ⅲ类和Ⅳ类。【结论】山茶转录组测序的Unigenes信息可作为SSR标记开发的有效来源,为山茶的遗传多样性研究、亲缘关系鉴定以及分子标记辅助育种等奠定了一定的理论基础。      

蒙药冷蒿转录组SSR信息分析

利用MISA(Micro SAtelite)软件对测序得到的蒙药冷蒿转录组序列143 700条跨叠群(contigs)进行简单重复序列(SSR)位点的挖掘,发现3 614条序列含有3 753个SSR位点,发生频率为2.51%,共有122种重复基元,平均每18.46 kb出现1个SSR位点。冷蒿转录组序列的SSR主要集中在三核苷酸重复(56.12%),其次是二核苷酸重复(31.60%)。AC/TG、AT/TA、CA/GT、AAT/TTA和AAC/TTG是二核苷酸、三核苷酸中的优势重复基元。冷蒿转录组SSR以5~12次重复为主,基序长度主要集中于12~36 bp。冷蒿转录组共注释43 415个contigs,其中578个SSRs位于编码区,主要以三核苷酸重复为主(397,68.69%)。从分子水平和生物信息学角度介绍了蒙药冷蒿转录组SSR信息的开发利用,其出现频率高、重复类型丰富,将为冷蒿的分子标记辅助育种、遗传多样性分析、遗传图谱构建和功能基因挖掘提供了候选序列。     

辣木转录组SSR位点信息分析

采用MISA对15 824条长度大于1kb的辣木Unigene进行SSR位点分布频率和基本特征的分析,共检测到8 272个SSR位点,分布于6 003条Unigene,SSR位点出现频率为52.28%,共包含114种重复单元。辣木转录组的SSR以单核苷酸重复为主,占总SSR的55.69%。其次是二、三核苷酸重复,分别占总SSR的32.34%和11.24%。A/T、AG/CT和AAG/CTT是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸中的优势重复基元。辣木转录组SSR以10~20次重复为主,基序长度主要集中于12~19bp。结果表明辣木转录组中含有大量SSR,且类型丰富,可为辣木SSR引物开发提供候选序列。     

利用芥菜转录组信息挖掘SSR标记及用于种质分析

【目的】为开发高效的芥菜Brassicajuncea.分子标记。【方法】本研究通过对芥菜转录组测序的信息搜索SSR位点并分析其分布特点,应用Primer 3.0软件设计SSR引物,随机选择50对引物扩增44份芥菜种质,检测其多态性。【结果】芥菜转录组测序共获得55 636条unigene,全部序列有48 193 376 bp;有7 834条unigene包含SSR的序列,从中鉴定出9 526个SSR位点,其中有1 371条序列包含1个以上SSR,复合SSR有572个,SSR发生频率为14.08%。优势重复基序为三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR的51.12%和41.91%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元,占总位点的34.74%,三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主,占总位点的18.30%。共设计出21 282对SSR引物,随机选择50对引物进行PCR扩增,其中41对扩增出清晰可重复的预期条带,17对(占34%)在44份芥菜种质中表现出多态性。应用UPGMA得到将44份供试材料分为4大类聚类图,可准确地体现了芥菜种质材料的关系。【结论】根据芥菜转录组数据能开发出类型丰富、效率较高的SSR标记,为芥菜亲缘关系分析和遗传图谱构建等提供更可靠的标记。     

基于棉花转录组测序的SSR分子标记的开发

通过对棉花转录组进行测序获得的57 695条Unigenes,利用MISA软件进行搜索,得出简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)的分布情况,共挖掘检索得到1 886个SSR位点,SSR的出现频率为3.27%。所有SSR位点分布于1 759条Unigenes上,发生频率为3.05%,平均每20.8 kb会出现1个SSR位点。有117条Unigenes含有1个以上SSR位点,含有复合型SSR的Unigenes数目为56条,其中三核苷酸基元类型分布最多,SSR数量为1 582个,占挖掘出总SSR数量的83.88%,而单、二、四、五、六核苷酸重复类型所占的比例较小。最后通过Primer 3程序进行SSR引物设计,得到部分引物序列,可用于棉花遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及种质资源的保存等。     

基于转录组序列的芜菁SSR标记开发及应用

为了研究芜菁(Brassica rapa L.)种质资源的多样性水平,本研究采用转录组测序的方法挖掘芜菁的SSR分子标记。结果表明：转录组测序分析共获得了253 720条unigene,其中13 247条unigene序列中含有2个或2个以上SSR位点,SSR的发生频率为25.05%,平均每3.15 kb出现1个SSR,分布频率为31.42%。30对引物最终均获得了多态性高、条带清晰的结果,共扩增出多态性条带有126条,平均每对引物扩增出4.2条,平均多态率100%。根据电泳检测扩增结果,最终得到24对多态性高、条带清晰的芜菁SSR引物,24对SSR引物在50份芜菁材料中共扩增获得了101个等位基因,平均每个位点等位基因数4.21个,分析显示,平均有效等位基因数(Ne)为1.481 7个,有效等位变异率为35.19%,这些结果表明,筛选出的引物能较好地表现50份芜菁的遗传多样性,同时对于更多芜菁品种的DNA指纹图谱构建和杂交种鉴定均具有重要意义。     

利用转录组数据开发意大利蜜蜂的SSR分子标记

意大利蜜蜂(简称意蜂)是自然界重要的授粉昆虫,广泛用于世界各国的养蜂生产,具有很高的生态和经济价值。为了开发意蜂的SSR分子标记,利用MISA软件对基于前期获得的意蜂幼虫肠道转录组数据组装得到的12 115条unigenes进行搜索,共预测出分布于2 149条unigenes的6 312个SSR位点,其中主要的重复类型为二核苷酸重复(54.42%)和三核苷酸重复(32.49%),主要基元为AT/AT(31.2%)和AG/CT(18.6%)。进一步利用软件设计出18 444对特异性引物,随机选取24对引物对国内3个不同来源的意蜂幼虫样品进行SSR位点扩增,有22对成功扩增出目的片段。研究开发出的SSR分子标记可用于意蜂的种群遗传和分子进化等研究,结果表明利用转录组数据鉴定非模式生物SSR位点的方法可行且高效。     

基于转录组数据的月季SSR标记开发及花色遗传性分析

在转录组数据的基础上,以Rosa laxa(疏花蔷薇)、R.rugosa‘White’(‘白玫瑰’)、R.cv.‘Pink Peace’(‘粉和平’)、R.multiflora var.albo-plena(白玉堂)、R.xanthina Lindl f.normalis(单瓣黄刺玫)5个亲缘关系相差比较远的种或品种为筛选和开发SSR引物的植物材料,基于所开发引物对杂交组合‘电子表’ב红法兰西’所得的79株F_1代群体进行了遗传多样性评价。结果表明:1)设计SSR引物80对,筛选出具有目的条带的SSR引物44对,具有多态性的SSR引物28对。2)对‘电子表’ב红法兰西’的F1代群体的遗传多样性进行评价,杂交F1代群体的遗传距离在0.52~0.94之间。3)聚类结果与后代的花色分离有一定相关性,当遗传距离为0.52时,F1代群体聚为2大类,其中一类跟母本‘电子表’(HT-13)聚为一类,花色大多是黄色;另一类跟父本‘红法兰西’(HT-12)聚在一起,花色普遍为红色到粉色之间。研究认为,这一花色分离成因主要与花色遗传有关,在这方面红色对黄色为显性性状;这一分离情况可能也与色素黄酮与花色素苷等色素代谢途径有关。     

怀菊转录组中SSR位点信息分析

以转录组测序数据为基础,利用MISA软件对简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)进行检测及分析,分析怀菊转录组中的SSR位点信息,并设计SSR引物,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测等提供参考。结果表明,共检测到8 553个SSR位点,它们分布在7 369条Unigene中,出现频率为2.83%,SSR位点的发生频率为2.44%;其中单核苷酸重复基序最多、其次为三核苷酸重复基序。怀菊转录组基序长度主要集中于12～19 bp,多具有中等多态性。对SSR序列设计引物,共得到25 662对引物可供今后使用。总之,怀菊SSR位点类型丰富,具有良好的多态性潜力及可开发性。