木薯蔗糖转运蛋白基因的表达分析

以木薯SC124为材料,分别在植株发育8个时间点取其块根和功能叶,利用实时定量PCR技术（qPCR）对木薯SUT1、SUT2、SUT4三类蔗糖转运蛋白基因表达差异进行研究。结果表明,在木薯块根形成期（90 d）3类SUT表达的日变化中,功能叶和块根中均以中午12 h最高,其余时间较低,叶片中SUT1和SUT2表达水平较高而块根中差异不显著;在整个发育过程中,叶片表达水平高于块根,且二者均为前期表达水平高,后期下降,3个SUT之间的表达量也有着明显的差异,叶片中SUT1的表达量最高,其次是SUT2,SUT4最低,在块根中除60 d时SUT1的表达量较高外,其它SUT表达量均较低,SUT4在叶片和块根中的表达量差异不大。     

木薯DBE和SBE基因的序列分析及其茉莉酸甲酯诱导表达特性

为研究木薯中调控支链淀粉合成的DBE和SBE基因如何被茉莉酸信号调控,首先对木薯基因组数据库中的MeDBE和MeSBE2.1基因进行序列分析,二者都具有α淀粉酶催化结构域且启动子区都具有茉莉酸响应元件等多种响应元件。以木薯品种‘华南八号’悬浮培养细胞为材料,利用qRT-PCR检测木薯MeDBE和MeSBE2.1基因在茉莉酸甲酯处理后的表达特性。结果显示：MeDBE基因的表达在最初短暂上调后持续下调,而MeSBE2.1则持续上调后又恢复最初水平,说明MeDBE和MeSBE2.1基因可被茉莉酸信号调控,进一步推测表明,其受到不同激素信号整合后的综合调控,以影响支链淀粉的生物合成。     

木薯MeHDS2基因的克隆与分析

采用RT-PCR技术,从木薯SC124 cDNA中克隆得到一个具有完整阅读框的基因,命名为MeHDS2,该基因全长2 529 bp,编码842个氨基酸。蛋白质保守结构域分析结果表明,MeHDS2蛋白含有保守的1个HD结构域、1个b-zip结构域、1个START结构域和1个MEKHLA结构域;蛋白质空间结构预测显示其具有3个典型的α螺旋结构;亚细胞定位结果表明,MeHDS2蛋白在植物细胞核中特异表达,因此,推测其为HD-ZIP转录因子家族中的一员。基因表达分析结果表明,MeHDS2基因在木薯根、茎、叶中都有表达,但表达丰度不同。木薯干旱处理14 d后,自形态学顶端往下数第三、四片叶片的MeHDS2表达量显著高于根、茎及其他位置叶片组织。本研究为木薯抗旱分子育种提供了理论基础。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

木薯MeNRT2.1基因的克隆及表达分析

木薯具有产量高、抗贫瘠等特点,为了了解其耐贫瘠的作用机理,提高木薯在贫瘠土壤中对氮素的利用率,以培养20 d的"华南5号"木薯组培苗为实验材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,获得一个高亲和硝态氮转运蛋白(NRT2)基因,命名为Me NRT2.1,该基因含有1 593 bp的开放阅读框架,编码530个氨基酸。生物信息学分析结果表明,木薯Me NRT2.1与苜蓿、拟南芥、可可、杨树等物种的NRT2.1同源性高,其中与可可树Tc NRT2.1的亲缘关系最近,氨基酸相似性达到90%。实时荧光定量PCR检测结果表明,Me NRT2.1在木薯组培苗的根中表达,并且在NO_3~-浓度为0.2 mmol/L时,其相对表达量较高,NO_3~-浓度为10 mmol/L时其相对表达量较低,NO_3~-浓度为0时几乎不表达;Me NRT2.1在茎、叶中也几乎不表达,即该基因具有诱导型组织特异性表达模式。原生质体瞬时表达发现Me NRT2.1定位在细胞膜上。此研究为进一步通过NRT2基因提高木薯的抗逆性奠定了基础。     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的启动子的克隆与序列分析

MeLTI6A（Manihot esculenta low temperature inducible 6A）是木薯低温干旱诱导基因,本研究从MeLTI6A 的序列出发,利用电子克隆设计引物进行PCR扩增的方法获得该基因的启动子,其序列共1 304 bp。生物信息学分析发现该启动子中具有真核生物典型的核心启动子区（TATA-box和CAAT-box）,并利用α-互补,蓝白斑筛选原理验证了该启动子核心序列具有活性;该启动子具有与干旱胁迫相关的激素类（如脱落酸、乙烯）的响应元件和逆境胁迫（如低温、干旱胁迫）的响应元件;还具有与木薯组织特异表达相关的调控元件和其它光响应元件;并通过Real time PCR检测了低温胁迫（4 ℃）下的木薯组培苗中MeLTI6A的表达变化,说明了该启动子区的低温胁迫顺式作用响应元件可能调节MeLIT6A在低温胁迫下的表达。这些说明木薯的MeLIT6A基因可能是通过对干旱胁迫激素信号响应以及逆境胁迫响应起作用,使木薯获得一定的抗胁迫的能力,同时还可能参与了木薯相关组织发育过程的调控。本研究有利于对MeLTI6A基因抗逆境胁迫功能的理解,为探索木薯高效抗逆的分子机制作初步研究。     

马蓝IGPS基因的克隆、表达分析及原核表达

吲哚-3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase,IGPS)是广泛参与生物体内色氨酸、生长素等吲哚化合物合成途径中重要的关键酶之一.为了研究BcIGPS在马蓝吲哚类生物碱合成中的作用,基于马蓝转录组数据,通过RT-PCR技术从马蓝中克隆得到IGPS基因序列,命名为BcIG...     

番荔枝AsCO基因的克隆及表达

应用RACE方法克隆得到番荔枝CO同源基因cDNA的全长,命名为AsCO(基因登录号:KJ699387)。AsCO基因开放阅读框1 083 bp,编码360个氨基酸,推测蛋白质分子量为39.65 ku,等电点为4.72。序列分析结果显示:AsCO基因编码的蛋白氨基端具有2个典型的B-box型锌指结构域,碳端具有CCT结构域,属于第一类CO基因。同源性分析结果表明,AsCO蛋白与北美木兰CO蛋白亲缘关系最近,与其它植物的亲缘关系较远。定量RT-PCR分析结果表明,AsCO基因在去除叶柄的花芽中表达量比不去叶柄的表达量高,在花蕾发育的不同阶段呈现先上升再下降的趋势。     

巴西橡胶树HbGRF基因的克隆、物理定位及表达分析

生长调控因子（growth-regulating factors,GRF）是植物特有的一类转录因子,该转录因子家族成员数目较多,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。以巴西橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为材料,通过RT-PCR方法进行HbGRF基因的克隆;利用生物信息学的方法对其蛋白序列、理化性质、基因结构、进化关系进行分析;利用IS-PCR技术和FISH技术对其进行物理定位分析;采用qRT-PCR对橡胶树中HbGRF基因的表达模式进行研究。结果表明：在橡胶树雌花中克隆到3个GRF基因,分别命名为HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3,分子量分别为65.663、41.188、52.858 kDa,其编码的蛋白长度分别为609、384、494 aa,均为不稳定蛋白;3个基因均具有GRF完整的特征结构域WRC和QLQ,分别属于3个不同亚族。基因物理定位结果表明,HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因分别位于橡胶树染色体的第11号长臂、第5号短臂和第9号长臂上,基因到着丝粒的平均百分距离是77.65、42.66和65.27。表达结果显示,橡胶树3个HbGRF基因在茎尖、雌花等生长旺盛的组织中表达量较高,用外源赤霉素和脱落酸处理后,发现表达量呈上升趋势,经过48 h后表达量和初始值基本持平,3个基因在茎尖、雌花中有明显的表达特异性,可能在橡胶树花芽分化及雌花的发育过程中起到了重要作用。该结果为研究橡胶树HbGRF基因的功能及作用机制奠定了理论基础,为橡胶树精准育种提供了分子细胞学依据。     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

滇水金凤LWD基因的克隆及表达分析

WD40是转录因子大家族,具有调节花青素苷生物合成、植物生长发育及非生物胁迫响应等功能,LWD（LIGHT-REGULATED WD）基因是该家族中已知的生物钟调节因子,但目前有关植物LWD基因的报道较少,其功能还有待深入研究。为探究LWD基因对滇水金凤花色的影响,本研究以滇水金凤花器官为材料,采用RT-PCR等技术克隆得到2个滇水金凤LWD基因,分别命名为IuLWD1和IuLWD2,其cDNA全长分别为1041 bp和1032 bp,分别编码347个和344个氨基酸。基本理化性质分析显示,IuLWD1和IuLWD2的GC含量分别为46%和50%,相对分子量分别为38 838.47 kDa和39 029.65 kDa,理论等电点分别为4.71和4.70。IuLWD1和IuLWD2的不稳定指数分别为53.60和52.58,均属于不稳定蛋白;其总平均亲水指数分别为-0.388和-0.366,均为亲水性蛋白。结构域分析显示,IuLWD1和IuLWD2均含有6个典型的WD40-repeat保守结构域,属于WD40超家族。多序列比对发现,IuLWD1和IuLWD2氨基酸序列与牡丹、葡萄及杨梅等氨基酸序列相似度较高。系统发育分析表明,IuLWD1与葡萄和牡丹聚为一支,同源性达85%;IuLWD2与杨梅聚为一支,同源性达90%,然后共同聚类在一支,推测2个基因为旁系亲缘关系。qRT-PCR分析表明,IuLWD1和IuLWD2基因在4种不同花色滇水金凤及其4个不同发育阶段均有表达,均以深红色表达量最高,白色表达量最低,2个基因的表达量均与花色呈正相关,且IuLWD1基因的表达量高于IuLWD2基因的表达量,表明IuLWD1和IuLWD2基因均在滇水金凤花色素苷的生物合成中发挥了作用,且IuLWD1基因对滇水金凤花色形成的调控作用更强。该研究结果为进一步探究滇水金凤花色形成及变异机理、凤仙花花色改良及新品种培育奠定基础。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的cDNA序列,命名为HbCaM1-7。序列分析结果发现,HbCaM1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,HbCaM1-6间氨基酸同源性为100%,HbCaM7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,HbCaM1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,HbCaM1-6在各组织中均有表达,除了HbCaM3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而HbCaM7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,HbCaM2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中HbCaM1-5圴呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。     

木薯苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其对低温胁迫的响应

本研究从全基因组水平对木薯（Manihot esculenta Crantz）苯丙氨酸解氨酶编码基因（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）进行鉴定,并以木薯品种KU50为材料克隆了6个PAL基因,分析了低温胁迫（7 ℃）对叶片MePAL表达模式、PAL酶活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力的影响。结果表明：低温处理使木薯叶片迅速萎蔫卷曲,并伴随叶片PAL酶活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力的显著提高。Real-time PCR分析表明,在低温处理前,MePAL1和MePAL2的相对表达量分别为0.83和1.19,显著高于其他4个MePAL基因,低温处理后6个MePAL基因均不同程度受低温胁迫诱导增强表达,其中MePAL5上调最高,达50.5~142.5倍。本研究结果初步显示低温胁迫上调了木薯叶片MePAL的表达,促进了总酚和类黄酮的合成,提高了抗氧化损伤的能力。     

巴西橡胶树SnRK1家族基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶I(Sn RK1)是植物糖信号途径的关键因子,广泛参与植物生长发育。以蓖麻Sn RK1基因序列为探针,采用同源克隆的方法获得了橡胶树Sn RK1家族2个基因的全长c DNA,分别命名为Hb Sn RK1-1(KX237690.1)和Hb Sn RK1-2(KX237691.1)。2个Hb Sn RK1基因均编码含515个氨基酸且序列高度一致(96.5%)的蛋白质;2个基因均含10个外显子、9个内含子,且外显子大小相近,但基因长度差异明显。在6种橡胶树组织中,2个Hb Sn RK1基因均有表达,但Hb Sn RK1-1在胶乳(产胶细胞乳管的细胞质)中的表达量明显高于Hb Sn RK1-2;在叶片发育不同时期,Hb Sn RK1-1的表达变化不显著,而Hb Sn RK1-2的表达随叶片发育明显下降;在胶乳中,Hb Sn RK1-1的表达显著受乙烯和茉莉酸诱导、受2,4-D抑制,但Hb Sn RK1-2表达受激素处理的影响较小,推测Hb Sn RK1可能参与胶乳再生的激素调控。     

木薯MeSAP13基因的克隆及其抗细菌性枯萎病功能鉴定

胁迫相关蛋白（stress-associated proteins, SAPs）在植物对胁迫应答和胁迫调控中起重要作用。木薯是我国重要的粮食作物和经济作物,细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）已严重危害我国木薯产业的健康发展。为了探讨木薯MeSAP基因在抗细菌性枯萎病中的作用,本研究克隆了我国主栽木薯品种‘华南8号’（SC8）的MeSAP13基因,分析该基因在细菌性枯萎病病原菌侵染时的表达模式及其编码蛋白的基本特性。利用基于木薯花叶病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）技术抑制了MeSAP13基因在木薯SC8叶片中的表达,通过接种细菌性枯萎病病原菌XpmHN11对MeSAP13的抗病功能进行抗性鉴定。结果发现：在病原菌XpmHN11侵染叶片3 d后MeSAP13基因表达量显著上调,说明木薯MeSAP13基因能够响应病原菌的侵染;在VIGS载体转化木薯叶片40 d后发现,与转化pCsCMV-A载体的对照叶片相比,MeSAP13在转化pCsCMV-MeSAP13叶片中的表达量显著下调了40%~60%,表明通过VIGS技术成功抑制了MeSAP13在木薯叶片中的表达。将病原菌XpmHN11接种至MeSAP13基因沉默叶片和对照植株叶片,发现MeSAP13基因沉默植株接种叶片的水渍状病斑面积显著大于对照植株接种叶片。分析侵染后0、3、6 d病原菌XpmHN11的繁殖情况发现,在侵染后3 d和6 d的MeSAP13基因沉默植株接种叶片中,其病原菌数量显著高于对照植株接种叶片。以上研究结果表明,抑制MeSAP13基因的表达,降低了木薯对细菌性枯萎病的抗性。     

木薯淀粉分支酶基因克隆及反义表达载体的构建

利用RT-PCR方法,用木薯块根cDNA做模板克隆获得支链淀粉合成的关键酶基因SBEII,经序列分析,同源性为98.07%;以PCAMBIA1301为基础,构建了以块根特异表达启动子Sporamin驱动的SBEII基因反义结构的植物表达载体.     

花生脂质转运蛋白家族基因的克隆与表达分析

植物脂质转运蛋白（Lipid transfer protein,LTP）作为一类小分子碱性蛋白在脂类物质的运输、生殖发育,抵御不良环境等方面具有重要的作用,此外,LTP还作为一种过敏原存在。通过构建花生未成熟种子全长cDNA文库,克隆到了5类LTP基因,按照编码蛋白分子量的大小命名为AhLTP-11.5,AhLTP-12.8,AhLTP-11.8,AhLTP-8.3和AhLTP-19.2。生物信息学预测表明AhLTP-11.5属于AAI_LTSS蛋白家族的nsLTP1亚族,AhLTP-11.5编码蛋白的N端有26个氨基酸残基的信号肽序列,ProtCompv8.0预测结果显示该蛋白为分泌蛋白,胞外定位。从系统发育树中可以看出,花生的AhLTP-11.5和拟南芥的AthLTP亲缘关系较近。半定量RT-PCR结果表明AhLTP-11.5基因在花生茎、叶、花和种子中均有表达,在根中几乎检测不到 在花生种子的不同发育时期AhLTP-11.5基因在DAP15d时表达量较低,20d以后表达趋于稳定。