不结球白菜S位点受体激酶基因片段的克隆与表达分析

以不结球白菜自交不亲和系03的基因组DNA和柱头cDNA为模板,利用引物SRKF/SRKR扩增获得长度为964 bp和646 bp的SRK基因片段。序列比较分析表明,克隆的基因片段属于SRK基因的激酶域,该序列包含4个外显子和3个内含子,编码215个氨基酸,与芜菁、甘蓝、芥蓝等SRK基因有90%以上的相似性。荧光定量PCR分析结果表明:自交不亲和系03和自交亲和系105不同组织中SRK基因的表达水平存在显著的差异,SRK基因主要在自交不亲和系的柱头中高度表达,自交亲和系中该基因的表达主要分布于叶片、花蕾和柱头组织中。     

珍稀植物华木莲SRK基因的克隆与亚细胞定位

[目的]利用杂种优势是植物育种的重要目的,但对于自交不亲和物种来说,因为亲本杂合,很难充分利用最大杂种优势.自交不亲和是开花植物避免近交的重要繁育机制,自交不亲和与自交亲和相互转换在自交不亲和物种中非常普遍,这种转换可为自交不亲和物种育种开辟新的途径.华木莲(Sinomanglietia glauca)为木兰科珍稀物种,有重要科学价值和良好应用前景,但适应能力差,自我更新能力弱.华木莲呈现迟发性自交不亲和特征,自交不亲和机理尚不清楚.从华木莲转录组中鉴定出了与孢子体自交不亲和反应关键基因S位点受体激酶(S-locus receptor kinase,SRK)基因高度同源基因SgSRK,这是唯一一类与已知自交不亲和基因高度同源的迟发性自交不亲和基因,因此了解该基因的作用成为研究华木莲自交不亲和机理的出发点.克隆基因、分析其编码蛋白理化性质及亚细胞定位是进行基因功能分析的前提,因此了解SgSRK基因克隆与亚细胞定位可为揭示该基因在华木莲自交不亲和中的作用提供参考.[方法]以自花授粉后3h华木莲心皮为材料,根据转录组扩增出了SgSRK基因,对其编码蛋白分析了理化性质,鉴定了结构域,推断了疏水性、信号肽、跨膜结构,并对其亚细胞定位进行了预测.为探讨SgSRK基因与已知的不同物种SRK基因演化关系,基于蛋白序列利用最大似然法构建了系统发育树.将目的基因和GFP基因构建了重组表达载体并转化农杆菌,然后将含有目的基因重组表达载体的农杆菌直接注射烟草叶片,3d后利用荧光显微镜观察叶片注射部位基因瞬时表达情况,确定其编码蛋白的亚细胞定位.[结果]SgSRK基因共计2463 bp(GenBank登录号:MW139903),编码蛋白含有820个氨基酸,编码蛋白具有4个结构域:B_lectin、S_locus_glycop、PAN-2、Pkinase Tyr结构域,有跨膜结构,存在信号肽,因此编码蛋白质可分为膜外域、跨膜域、胞内磷酸激酶域.共聚焦荧光显微镜观察表明,该基因蛋白产物定位在细胞质中和细胞膜上,细胞膜上表达更多.[结论]SgSRK基因具有植物SRK基因典型特征.     

甘蓝自交不亲和细胞信号转导的功能基因研究进展

自交不亲和性是开花植物防止近亲繁殖而广泛存在的一种遗传屏障,在育种工作中意义重大,它在遗传上受一个带有复等位基因的多态性S基因座所控制。本文综述了近年来在甘蓝自交不亲和信号转导途径中相关功能基因的研究进展。SRK基因和SP11/SCR基因是控制甘蓝自交不亲和性的两个关键因子。SRK基因是雌蕊柱头中自交不亲和反应的专一决定因子,编码SP11/SCR基因的蛋白在花药壁和花粉中特异表达。编码SLG基因的蛋白在自交不亲和反应中起增强SRK活性的作用。另外也对信号传导途径中下游蛋白质的作用模式作了展望。     

基于SRK和SCR序列的甘蓝自交不亲和系单倍型分析

采用RT-PCR和其他分子生物学方法,以甘蓝自交不亲和系E1和F1柱头cDNA为模板扩增SRKE1和SRKF1基因,以花药cDNA为模板扩增SCRE1和SCRF1基因.经序列比对首次证明E1和F1材料分别为S28和S7单倍型.经三维结构分析,预测SCRE1上C5-C6和C7-C8之间氨基酸序列决定SCRE1的单倍型特异性,SRKE1上TNNSFYSRLKVS序列决定了SRKE1的单倍型特异性,并对两者相对作用的关键氨基酸位点进行了分析.     

基于SRK和SCR序列的甘蓝自交不亲和系单倍型分析

采用RT-PCR和其他分子生物学方法,以甘蓝自交不亲和系E1和F1柱头cDNA为模板扩增SRKE1和SRKF1基因,以花药cDNA为模板扩增SCRE1和SCRF1基因.经序列比对首次证明E1和F1材料分别为S28和S7单倍型.经三维结构分析,预测SCRE1上C5-C6和C7-C8之间氨基酸序列决定SCRE1的单倍型特异性,SRKE1上TNNSFYSRLKVS序列决定了SRKE1的单倍型特异性,并对两者相对作用的关键氨基酸住点进行了分析.     

等电聚焦电泳法测定羽衣甘蓝自交不亲和性的研究

利用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法,研究了羽衣甘蓝强自交不亲和系、弱自交不亲和系与自交亲和系的柱头和花粉蛋白质谱带,并进行自交,以考察亲和指数。结果表明:强自交不亲和系的成熟柱头(S)和弱自交不亲和系的成熟柱头的蛋白谱带有明显差异;强自交不亲和系有特异谱带的出现,而弱自交不亲和系和自交亲和系柱头上没有特异谱带。对比自交不亲和系开花前2~3 d的柱头(S′)与成熟柱头(S)的蛋白质谱带发现了S特异蛋白质的准确位置,其等电点为8.5~9.1。此法可用于鉴定羽衣甘蓝的自交不亲和性。用同种方法处理花粉,没有发现自交不亲和系的特征谱带。     

等电聚焦电泳测定甘蓝自交不亲和性研究

利用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法研究了甘蓝（ＢｒａｓｉｃａＯｌｅｒａｃｅａＬ．）自交不亲和系与亲和系的柱头和花粉蛋白质谱带,并进行自交,以考察其亲和指数。结果表明,自交不亲和系与亲和系的柱头蛋白质谱带有明显差异：６条带只出现于自交不亲和系中;亲和系柱头没有特异带。对比自交不亲和系开花前２～３天的柱头与成熟柱头的蛋白质谱带,发现了Ｓ特异蛋白质的准确位置,其等电点约为８．３～８．５。此法可用于鉴定甘蓝自交不亲和性。以双蒸水和疏基乙醇作为提取液处理花粉,均未发现自交不亲和系的特征谱带。     

赛买提杏自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

[目的]克隆新疆主栽杏(Prunus armeniaca)赛买提自交不亲和性花粉SFB基因全长序列,为今后通过分子改良培育具有自交亲和性的赛买提杏奠定基础.[方法]通过RT-PCR法克隆获得赛买提杏花粉SFB基因中间片段,RACE技术克隆cDNA全长,DNAMAN预测其氨基酸序列,并将编码蛋白与自交亲和的杏SFBC基因进行比对.[结果]克隆到1个全长为1 373 bp的SFB基因,命名为SFB60(GenBank登录中).该基因包含1个1 122 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸.与SFBC基因相比,该蛋白有2个变异区(V1和V2)和2个高变区(HVa和HVb),N端有一段由42个氨基酸组成的F-box结构域,而SFBC基因缺少2个高变区.[结论]获得了赛买提杏花粉自交不亲和SFB60基因cDNA全长序列,为进一步以分子育种的方法来改良赛买提杏的研究奠定了基础.     

芸芥果胶酸裂解酶基因的克隆及序列分析

采用RACE技术从芸芥自交亲和系花药中克隆出果胶酸裂解酶(Pectate lyases,PL)基因,全长1 657bp,其完整开放阅读框(Open Read Frame,ORF)为1 371bp,编码456个氨基酸,分子质量51.179ku,等电点9.42。序列比对结果表明,该蛋白与其他植物的PL蛋白具有较高的同源性,因此命名为EsPL。进化树分析表明,芸芥EsPL基因与十字花科芸薹属植物甘蓝型油菜、白菜型油菜的PL基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果显示,EsPL在芸芥开花后自交亲和系花药中的表达量显著高于自交不亲和系花药中表达量,该基因可能在芸芥自交亲和性状调控过程中发挥重要作用。     

萝卜自交不亲和特性的荧光快速鉴定

以萝卜高代自交系为材料,利用荧光显微镜观察其花期和蕾期自花授粉的柱头与花柱,结果发现自交不亲和与自交亲和材料花粉萌发和花粉管伸长状况存在明显差异.自交不亲和材料花期授粉后柱头上出现严重的胼胝质反应,花粉很少萌发,即使萌发也不能正常生长,出现弯曲或背向生长,花粉管顶端膨大不能穿越柱头乳突细胞;自交亲和系萝卜单株花期、蕾期以及自交不亲和系单株蕾期授粉后花粉多数能够正常萌发并穿越柱头进入子房.对供试材料进行了田间自交亲和指数测定,结果与荧光显微镜测定法鉴定结果高度一致.因此利用荧光显微镜观察法可以准确快速鉴定萝卜的自交不亲和性,从而提高优良自交不亲和系选育效率.