草莓FaSAMS1蛋白的酵母外源表达及表达产物的酶学分析

草莓果实中S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因FaSAMS1参与草莓果实的成熟调控,但其蛋白的生物化学特性目前还不清楚。为了探讨草莓果实中FaSAMS1蛋白性质,本研究首先通过RT-PCR克隆了FaSAMS1基因的编码区cDNA序列,并成功构建了酵母表达重组载体pPICZA,进而转化酵母表达菌株X-33,最后成功诱导并纯化了FaSAMS1融合蛋白。对融合FaSAMS1蛋白的酶活性分析表明,反应体系中FaSAMS1蛋白含量为0.09mg,FaSAMS1蛋白浓度为0.454mg/mL,酶活力为0.32U,比活力为3.56U/mg,本研究为乙烯参与草莓果实成熟调控提供了生物化学证据。     

毕赤巴斯德酵母表达外源蛋白研究进展

毕赤巴斯德酵母表达系统具有真核生物表达的特点 ,现已广泛用于外源蛋白的表达。本文综述了其自身的优点 ,表达载体的特点 ,外源基因拷贝数的多少与表达产量的关系 ,分泌型蛋白的表达 ,表达外源蛋白所需的外部条件以及翻译后的加工和修饰过程     

转录因子Prm1和Mit1对毕赤酵母产外源蛋白的影响

【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P_AOX1诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),而用P_GAP组成型过表达Prm1,GFP的表达量无明显变化;利用P_AOX1诱导型和P_GAP组成型过表达Mit1,GFP表达量均极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除M...     

寄生疫霉ParA1蛋白在毕赤酵母中的表达

本研究构建ParAl蛋白真核表达系统,通过诱导表达、镍柱纯化等途径,获得具有高生物学活性的ParA1蛋白.将末端含6×His-tag的parA1基因整合到酵母胞内表达质粒pPICZ-A上,获得重组表达质粒pPICZ-A::parA1-His.重组表达质粒用BstX I酶切线性化后,电转化至毕赤酵母菌KM71H中,经含抗生素Zeocin的平板、MD平板筛选和PCR分析,鉴定得到阳性克隆.甲醇诱导重组酵母菌中ParA1蛋白表达,然后用镍柱纯化表达产物.Tricine-SDS-PAGE电泳检测发现,纯化后收集的蛋白电泳条带清晰单一,浓度约为75 mg/L.生物学活性检测表明所得的ParA1蛋白有较高生物学活性,在稀释6 000倍后仍可以强烈诱导烟草产生过敏反应.     

猪视黄醇结合蛋白在毕赤酵母中的表达及检测

采用RT-PCR技术从猪的肝脏中扩增到RBP基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC重组构建了重组表达载体pPICZαC-RBP,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经ZeocinTM抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,Western Blot分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有生物活性的RBP重组蛋白。     

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC 57质粒中测序后,用EcoR I 和Not I双酶切,连接到pPIC 9 k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His+Muts重组子.0.5%甲醇诱导表达96 h后,对发酵液和细胞进行SDS-PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6.0 kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符.用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329 mg/L.     

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC57质粒中测序后,用EcoR I和Not I双酶切,连接到pPIC9k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His^ Mut^ 重组子。0．5％甲醇诱导表达96h后,对发酵液和细胞进行SDS—PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6．0kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符。用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329mg／L。     

人源明胶基因在毕赤酵母中的表达

[目的]利用毕赤酵母重组获得明胶蛋白。[方法]构建基因工程菌,利用甲醇诱导表达。[结果]LC-MS/MS检测到了明胶蛋白。[结论]微生物重组表达特定分子量大小的明胶是可行的。     

人视黄醇结合蛋白基因的毕赤酵母表达载体构建

用PCR方法从pGEX-hRBP中扩增人视黄醇结合蛋白(retinol bingding protein，prop)，用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9，然后用T4连接酶将目的片段克隆到pPIC9载体中。分别用PCR方法和酶切方法验证了此载体构建成功，为下一步使用毕赤酵母进行真核表达人视黄醇结合蛋白打下基础。     

His标签的水稻硅转运蛋白表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1).     

草莓果实中FaSAMDC基因的克隆、生物信息学及表达分析

【目的】为明确S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)在非呼吸跃变型草莓果实成熟中的作用。【方法】以‘北农香’草莓果实为试验材料,首先通过RT-PCR克隆FaSAMDC基因,其次通过SqRT-PCR分析发育果实(小绿、大绿、褪绿、白果、片红、全红)中的FaSAMDC基因的表达量。【结果】结果表明,FaSAMDC基因含有1 116bp开放阅读框,编码371个氨基酸,含有典型的脱羧酶保守功能结构域。随着草莓的果实发育,FaSAMDC表达量呈明显下降趋势并且在白果时期达到最低值,此后随着果实着色,表达量迅速上升并且成熟期达到最高。【结论】以上研究结果证实,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶可能参与草莓果实的成熟调控。     

P1 of strawberry vein banding virus,a multilocalized protein,functions as a movement protein and interacts with the coat protein

Although the complete nucleotide sequence of strawberry vein banding virus (SVBV) has been determined and bioinformatic analysis has revealed that the SVBV genome could encode seven proteins, the precise function of each protein is unclear. This study provided evidence that the P1 protein of SVBV (SVBV-P1) possesses the following features. Bioinformatic and subcellular localization analyses showed that SVBV-P1 is localized in the cytoplasm and cell walls of epidermal cells in Nicotiana benthamiana, and it forms inclusion bodies associated with microtubules and the endoplasmic reticulum. Dilution experiments demonstrated that SVBV-P1 could move from the original agro-infiltrated cells to adjacent cells in N. benthamiana leaves. Further trans-complementation experiments demonstrated that SVBV-P1 could facilitate the intercellular movement of a movement-deficient potato virus X mutant in N. benthamiana leaves. Finally, yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation assays revealed that SVBV-P1 could interact with the SVBV coat protein, which is a major component of Caulimovirus virions. Results of the electrophoretic mobility shift assay indicated that SVBV-P1 lacks DNA-binding capability. In summary, the results suggest that SVBV-P1 is probably a movement protein of SVBV, providing new insights into the function of movement proteins of the Caulimovirus genus.     

日光温室草莓果实生长发育过程中糖、酸和Vc变化动态的研究

为了得到日光温室草莓果实发育过程中营养成分的变化动态规律，以全明星及丰香为试材，研究了草莓果实从落花后1周到成熟整个生长发育过程中各种营养成分的变化。结果表明，果实发育过程中总糖和蔗糖含量逐渐增加，从白熟期到成熟期增加最快；酸含量逐渐减少；Vc含量先降后升，在半红期达到最大，成熟期略有下降。     

草莓果实中七次跨膜受体蛋白生物信息学及时空表达特征分析

以草莓为试材,基于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、人(Homo sapiens)和家鼠(Mus musculus)等数据库信息,采用同源比对方法,结合ClustalX 2.0序列比对及MEGA 5.0系统进化树分析,对草莓基因组中7TMR的基础生物信息进行了分析。结果表明,草莓基因组中含有84个7TMR,包括23个亚家族。半定量RT-PCR分析表明,该家族全部成员中有33个成员随果实发育表达量明显上调,17个成员表达量明显下调;Real-time PCR分析进一步确认,部分7TMR成员的基因表达与果实发育及成熟过程的整个进程有着密切的关系。此外还发现,草莓中7TMR家族中含有一类特殊的亚家族蛋白,该亚家族与人和家鼠中的脂联素受体高度同源,表明草莓中7TMR存在着非G-蛋白偶联信号转导途径。草莓中类似脂联素受体亚家族ADIPOR包含5个成员,对这5个成员的时空表达和刺激应答进行了分析,发现其中某些成员不仅与果实发育进程关系密切,且对糖信号应答,暗示着该类蛋白在草莓果实发育和成熟调控中可能起着重要作用。     

利用小RNA深度测序快速鉴定草莓病毒

病毒侵染直接影响草莓的生长发育及果实品质,快速检测及鉴定病毒是病毒防治的前提.本研究以'丰香'草莓和'哈尼'草莓为试材,利用小RNA(sRNA)测序结合RT-PCR技术对2种栽培草莓品种中存在的病毒进行了研究.对sRNA测序结果进行组装和注释,结果表明:在混合样品中共有242个contigs比对到5种草莓病毒,分别为草...     

猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定

为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

草莓FaAP1基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达

为研究草莓AP1同源基因FaAP1的功能,构建了其植物表达载体pBI121-FaAP1,并导入到农杆菌菌株GV3101中。利用花序浸染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了3个转化株系。结果显示,与对照相比,转基因株系明显早花,成花时间可提早10d以上;同时其营养生长受到抑制,植株个体矮小,莲座叶数目减少;在早花的同时,转化株系花器官异常,不能形成种子。表明草莓FaAP1基因参与了成花过程的调控。     

壳聚糖添加助剂涂膜对草莓采后生理的影响

研究了壳聚糖添加助剂涂膜对采后草莓品质和生理的影响，结果表明：0.5%壳聚糖添加助剂涂膜可明显延缓果实维生素C含量的降低，减少腐烂，抑制草莓呼吸强度、内源乙烯释放量和MDA含量，提高SOD活性。     

草莓果实发育过程中Ca、K、Fe、P的变化动态研究

对达赛莱科特和447-3草莓果实发育期Ca、K、Fe、P含量的变化规律进行研究,进一步明确矿质元素对草莓果实品质的影响,旨在为草莓施肥和品质调控提供科学依据。结果表明:草莓果实发育期间果实内4种矿质元素含量大小顺序为K>Ca>Fe>P;K在整个草莓果实的发育过程中维持较高水平;Ca、P含量在果实发育前期较高,随果实发育成下降的趋势;Fe含量在果实发育过程中呈现出高—低—高—低—高—低的趋势。