水稻条纹病毒在玉米和水稻上流行差异分析

为了明确水稻条纹病毒(RSV)在水稻和玉米上发生程度差异明显的原因,从一个侧面了解RSV流行本质,2004年在洪泽进行田间试验。采用黄盘诱集、盘扑、盘刮、肉眼计数等方法比较武育粳3号和掖单13上灰飞虱侵入和消长动态,结果表明两者均只有一个成虫侵入高峰,单位面积迁入虫量前者是后者的3.6倍,单株平均虫量相近。Dot-ELISA法测定灰飞虱带毒率为40%,成虫迁移扩散高峰期22d内两者接毒量约为每天百株137头带毒虫。武育粳3号有二代若虫发生,掖单13则无。逐日调查发病进程,结果显示水稻发病率为60%,玉米为0。室内抗性鉴定,掖单13对RSV的抗性比武育粳3号高4个级别。综合以上结果,寄主品种抗性决定了RSV在水稻和玉米上流行状况,二代若虫重复侵染是RSV在水稻上重发的另一主要原因。     

RSV传毒媒介灰飞虱种群转移扩散规律及其数量控制技术

1990年以来，水稻条纹叶枯病(Rice Stripe Virus，简称RSV)在江苏发生逐年加重，2000年、2001年连续两年严重发生，有基本失收的田块，已对水稻生产构成了严重威胁和造成了重大的产量损失。灰飞虱数量逐年增加和感病品种广泛种植是RSV严重发生的主要原因，研究传毒媒介灰飞虱的种群转移扩散规律及其控制技术，对减轻该病的发生有现实意义。     

灰飞虱体内水稻条纹病毒基因的RNA干扰效应

【目的】探讨利用RNA干扰技术切断灰飞虱体内水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）繁殖的可行性,研究RSV病毒不同基因间的互作关系。【方法】利用喂食的方法测定体外合成的dsRNA对灰飞虱体内RSV基因表达的抑制作用。根据RSV基因序列设计并合成3种dsRNA（dsRdRp、dsNSvc4和dsCP）,分别喂食携带RSV病毒的2龄灰飞虱,96 h后利用荧光定量PCR技术同时检测灰飞虱体内RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP的表达量。【结果】经过特异性dsRNA喂食处理的灰飞虱体内RSV病毒靶基因NSvc4、CP的表达量大幅下调,下调幅度分别为93.2%和94.9%;靶基因RdRp表达量下调幅度为45.6%。dsRNA喂食处理对其它非靶标RSV基因的表达均具有一定的下调作用,表明RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP间可能存在互作关系。【结论】本研究为利用转dsRNA工程微生物或转基因水稻进行RSV病毒的防治提供了重要依据。     

水稻条纹病毒安徽分离物CP基因的克隆及序列分析

采集安徽庐江水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA.设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒安徽分离物(RSV-AH)的RNA3部分片段,克隆并测序.序列分析表明,该片段全长1051个核苷酸,其中包含的CP基因全长969个核苷酸,编码322个氨基酸.将RSV安徽分离物CP基因(AH-CP)与其它来源的RSV CP基因进行核甘酸序列相似性比较,结果表明,安徽庐江的RSV CP基因与江苏洪泽的RSV CP基因序列相似性最高,达99.3%.进一步构建RSV CP基因系统关系树,发现安徽庐江的RSV CP基因同样与江苏洪泽的RSV CP基因亲缘关系最近.     

水稻条纹叶枯病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

以提纯的水稻条纹叶枯病毒(RSV)粒子作为抗原免疫BALB/c小鼠脾细胞,并与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆筛选,获得1株能稳定分泌针对RSV蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1H2。利用该细胞株制备了腹水型单克隆抗体,经检测,该单克隆抗体的间接ELISA效价达1∶1.024×106,且与水稻、灰飞虱、褐飞虱和白背飞虱的蛋白均不发生交叉反应,检测的灵敏度为抗原蛋白稀释1∶2.14×104倍,对应的抗原浓度为25.89μg.L-1。按常规饱和硫酸铵沉淀法纯化了单克隆抗体1H2,测定其IgG含量为6.05 g.L-1。该单克隆抗体可用于监测田间RSV的发生动态。     

同一生境下RSV和RBSDV流行规律比较

水稻条纹病毒(RiceStripeVirus,RSV)和水稻黑条矮缩病毒(RiceBlackStreakDwarfVirus,RBSDV)是两种重要的水稻病毒,均由灰飞虱进行持久性传播,历史上也曾多次造成流行。但这两种病毒很少在一种作物上同时发生,玉米和水稻都是这两种病毒的寄主,RBSDV则一般危害玉米,而RSV却主要在     

水稻条纹病毒云南分离物CP基因克隆及序列比较分析

 对采自云南保山、楚雄、石林和宜良等4地的水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA,经RT-PCR扩增,获得4个RSV云南分离物的CP基因片段。序列测定表明,该片段长999 bp,其中CP基因由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。与其它已报道的RSV分离物CP基因进行同源性比较,发现我国RSV分离物可以划分为2个不同的组,大部分RSV云南分离物为一组,其它的RSV 分离物为另一组。以RSV-CXi分离物的CP与纤细病毒属的其它5种病毒的CP进行氨基酸同源性比较,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,而与RGSV亲缘关系最远。     

水稻条纹病毒安徽分离物NS3基因的克隆及其RNA沉默抑制子功能的初步鉴定

采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒(RSV)安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。     

a-干扰素治疗呼吸道合胞病毒肺炎疗效观察

目的探讨干扰素肌注治疗RSV肺炎的疗效.方法将60例RSV肺炎患儿随机分为两组,两组均采用综合治疗,观察组加用a-干扰素肌注,对治疗前后的疗效进行比较.结果观察组在治愈率、症状缓解、胸片恢复、体征消失方面均明显优于对照组(P＜0.05).结论a-干扰素肌注治疗小儿RSV肺炎可缩短病程,减轻症状,疗效确切,可作为治疗RSV肺炎的主要药物.     

基于粗提物的水稻条纹病毒体外“抓帽”体系

【背景】 布尼亚病毒目（Bunyavirales）和正黏病毒科（Orthomyxoviridae）病毒从帽子结构下游10—20个碱基处切割寄主mRNA,以5′端切割产物（帽子序列）作为引物起始自身基因组的转录,生成含一段异源帽子序列的病毒mRNA,这一过程称为“抓帽”。水稻条纹病毒（rice stripe tenuivirus, RSV）是一种布尼亚病毒,其“抓帽”机制还不甚清楚。【目的】 研究RSV粗提物能否从溶液中的外源mRNA“抓帽”,以建立一种便捷的体外体系,用于解析RSV“抓帽”和转录机制。【方法】 以PEG沉淀和超速离心法粗提RSV,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和质谱技术分析粗提物成分。然后取少量粗提液,加入富含珠蛋白（globin）mRNA的兔网织红细胞裂解液（rabbit reticulocyte lysate,RCL）和合适浓度的金属离子配制体外“抓帽”体系。待体外反应结束,提取体系中总RNA,以巢式RT-PCR扩增含珠蛋白-α mRNA帽子序列的RSV mRNA,并对其进行克隆,通过序列分析比较RSV体外“抓帽”与体内“抓帽”的异同。【结果】从100 g感染RSV的水稻叶片获得RSV粗提液2 mL。除RSV病毒粒子外,粗提液中还含核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶等多种叶绿体蛋白。取2 μL粗提液,加入4 mmol·L^-1 MgCl₂、2 mmol·L^-1 NTP、0.8 U·μL^-1 RNA酶抑制剂和8 μL RCL,配成20 μL反应体系,30℃孵育1.5 h后,巢式RT-PCR扩增到了目的条带,表明RSV粗提物能切割溶液中的珠蛋白-α mRNA,并利用其帽子序列合成自身mRNA。在反应体系中加入帽子结构类似物m⁷G（5′）ppp（5′）G后进行相同反应,目的条带变淡,且变淡程度与所加入m⁷G（5′）ppp（5′）G的浓度成正比,表明识别帽子结构是RSV从溶液中切割利用珠蛋白-α mRNA的前提。对巢式RT-PCR产物克隆和测序后分析发现,与在体内的情况类似,RSV从帽子结构下游的A或C处切割珠蛋白-α mRNA,得到的帽子序列与病毒模板链3′端的U或G配对后引发转录。在利用珠蛋白-α mRNA帽子序列进行转录的过程中,RSV频繁使用引发与重配,且在合成核蛋白基因NP时比在合成主要非核蛋白基因NCP时使用该机制的频率更高。【结论】 RSV粗提物能从溶液中的mRNA“抓帽”,且在切取和利用帽子序列的方式上,其表现与细胞内的RSV无明显差别。因而,粗提物可以用来解析RSV的“抓帽”机制,甚至用于研究RSV的转录。     

水稻条纹病毒云南分离物病害特异性蛋白基因的分子变异

对采自云南大理、陆良、禄劝、石林、玉溪、保山和宜良等地的水稻条纹叶枯病病样,提取病叶总RNA,经RT-PCR、cDNA克隆和序列测定,获得了水稻条纹病毒(Rice strip virus,RSV)7个云南分离物的SP基因序列,核苷酸长为537 nts,并与GenBank中已报道的RSV SP基因进行同源性比较,综合分析了云南RSV不同分离物SP基因的分子变异.对纤细病毒属6种病毒的SP蛋白氨基酸序列进行进化分析,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,与RGSV亲缘关系最远.     

湖北省水稻条纹叶枯病的发生与检测

由灰飞虱(Laodelphax striatellus)持久传播的水稻条纹病毒(RSV)引起的水稻条纹叶枯病在我国长江中下游粳稻种植区造成严重的损失。2011年,在湖北省孝感市一种植粳稻品种嘉优2号的田块中发现约10%的植株呈现典型的水稻条纹叶枯病症状,分子检测证实发病植株病原物为RSV,PCR产物TA克隆并测序进一步证实了发病植株病原物为RSV。灰飞虱能在湖北省越冬,并能传播水稻条纹叶枯病,因此,RSV对该区的粳稻种植存在潜在的威胁,应及早采取应对措施。     

利用RNAi技术防治水稻条纹叶枯病

 【目的】控制水稻条纹叶枯病的发生与流行,改变当前水稻一旦染毒就无药可治的现状。【方法】采用浸种与喷雾技术使生物疫苗进入稻株体内,通过稻株体内RSV带毒情况和疫苗残留情况室内检测以及水稻条纹叶枯病发病率的田间调查,确定生物疫苗对RSV表达以及条纹叶枯病的控制效果。【结果】在疫苗中添加1.0 ‰的B渗透剂是浸种的最适浓度,添加5.0‰的A渗透剂是喷雾的最适浓度;稻株体内疫苗检出率的比例与RSV的降解呈现一致性;浸种处理后疫苗在稻株体内能维持30 d以上,喷雾处理后的残留期为10—20 d。2种处理方式对条纹叶枯病的控制效果均超过了70%。【结论】生物疫苗可以作为一种新型的生物农药用于水稻条纹叶枯病的田间防治。     

水稻条纹病毒安徽分离物NS3基因的克隆 及其RNA沉默抑制子功能的初步鉴定

采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒（RSV）安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。     

利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质

【目的】筛选介体灰飞虱（Laodelphax striatellus,SBPH）中与水稻条纹病毒（RSV）病害特异蛋白（disease-specific protein,SP）可能发生相互作用的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制及SP在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA并通过TaKaRa D9086 OligtexTM-dT30 mRNA Purification Kit对mRNA进行纯化。利用SMART技术合成双链cDNA,利用Axygen的PCR纯化回收试剂盒将ds cDNA回收纯化,纯化后的ds cDNA再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR3-N相连接以构建高质量灰飞虱cDNA文库,通过电转化的方法对灰飞虱cDNA文库进行扩增并进行cDNA文库质量和滴度检测。设计带有SfiⅠ酶切位点的引物以扩增得到目的基因即RSV SP。将带有酶切位点的SP基因序列连接到载体pDHB1上构成诱饵载体pDHB1-SP。将诱饵载体pDHB1-SP转化酵母菌NMY51中并提取总蛋白,通过Western Blot方法检测诱饵载体上的目的基因SP是否表达,并通过功能验证试验验证诱饵载体是否适合本研究采用的分裂泛素酵母双杂交系统。确定构建的诱饵载体适合本系统后,用诱饵载体与文库质粒pPR3-N共转化到酵母菌NMY51中以优化cDNA文库筛选条件并明确3-AT浓度。对灰飞虱cDNA文库进行筛选并对筛选结果进行分析,对筛选出来的蛋白进行体内试验以进一步验证是否发生互作。【结果】提取到高质量的灰飞虱总RNA,通过SMART技术合成的ds cDNA大小介于0.1-4.5 kb。构建的灰飞虱cDNA文库的库容量超过1.2×106 cfu,文库滴度为1.12×108 cfu/mL,扩增文库插入片段平均长度大于1.5 kb。载体酶切验证表明诱饵载体pDHB1-SP成功构建;Western Blot结果表明诱饵载体pDHB1-SP能够在NMY51中正常表达;功能验证表明诱饵载体pDHB1-SP适合该系统。在3-AT浓度为20 mmol?L-1的筛选条件下从构建的高质量的灰飞虱cDNA文库中筛选得到534个克隆,经测序、Blast比对最终得到76个可能与RSV的SP发生互作的灰飞虱蛋白质。根据SP在灰飞虱体内的亚细胞定位结果以及通过gene ontology(GO)对蛋白质的功能分析,挑选出20个蛋白质进行共转和β-galactosidase检测,结果表明这20个蛋白质均与RSV SP互作。【结论】通过构建高质量灰飞虱cDNA文库及酵母双杂交技术,筛选出了与RSV SP互作的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制,及RSV的SP在传毒过程中的功能打下了基础。     

应用Real-Time RT-PCR鉴定2个水稻品种(品系)对水稻条纹病毒的抗性差异

应用Real-time RT-PCR检测了水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)在2种水稻品种(品系)武育粳3号和KT95-418的悬浮细胞内复制变化和相对含量的差异,结合传统生物学接种试验,确定了这2个品种(品系)对RSV抗性的差异.结果表明,RSV在武育粳3号的悬浮细胞内24 h达到复制高峰,病毒含量为侵染初期的7.46倍.而在KT95-418的悬浮细胞内,RSV达到复制高峰需要36 h,病毒含量为侵染初期的4.51倍.利用病毒生物学接种的方法,武育粳3号发病率达91.7%,而KT95-418仅为36.0%.由此可见,KT95-418较武育粳3号对RSV具有较高的抗病性.因此,Real-time RT-PCR方法与传统生物学接种试验方法相比,具有更高的准确性和灵敏性,可以作为传统品种抗病性鉴定的验证手段.     

RSV-寄主-介体三者间相互作用研究进展

为了解国内外关于水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)-寄主-介体三者间互作关系的研究现状,采用文献检索的方法,对研究结果进行总结和比较分析。结果表明:1)RSV自身编码蛋白间存在着较为复杂的直接互作,从而保证了病毒生命过程的有序衔接。2)RSV与寄主水稻及介体灰飞虱间的间接互作,大多与病毒造成的在植物上症状,病毒经介体卵传播等特点相吻合。3)RSV编码蛋白与介体因子间的直接互作,参与了病毒在介体中的复制,传播及抵御介体免疫等生命过程。4) RSV-寄主-介体三者间互作关系的研究已成为领域内的研究热点,国内每年高水平研究论文不断涌现。针对RSV-介体互作研究中病毒与介体遗传体系均不成熟的现状,提出以下的解决方案:加快RSV全长侵染性cDNA克隆的构建或者RSV微小复制子的构建;另外可以对现有的CRISPR/Cas9技术进行优化,尽快实现对灰飞虱进行高通量的基因敲除。     

水稻条纹叶枯病抗性基因SSR标记的筛选及应用

[目的]设计和筛选新的SSR引物,以用于水稻条纹叶枯病抗性改良的回交育种中。[方法]以高抗条纹叶枯病晚粳品种502,高感条纹叶枯病晚粳品种秀水09等常规晚粳品种及其衍生株系为材料,在利用SSR和SARP标记对高抗条纹叶枯病RSV1基因定位的基础上,进一步设计3对（M-11-1,M-11-2,M-11-3）SSR标记。通过筛选和分析,选择M-11-3作为检测RSV1基因的标记基因用于追踪RSV1基因,从而实现将RSV1基因导入秀水09等晚粳品种的回交育种中,鉴定各个株系的抗性表现。[结果]改良系的条纹叶枯病抗性明显高于秀水09,绝大部分的抗性接近供体水平,而且在不同年份间抗性表现稳定,因此试验中利用的RSV1基因抗性效应十分明显,与RSV1基因连锁标记M-11-3辅助选择准确。[结论]研究证明了分子标记用于水稻条纹叶枯病抗性改良的可行性,同时也表明,优化和发展新的标记基因能够有效提高标记辅助选择的效率。     

水稻条纹病毒外壳蛋白叶绿体离体跨膜运输研究

【目的】明确离体条件下水稻条纹病毒（RSV）外壳蛋白（CP）能否进入叶绿体,为研究RSV的致病机理提供依据和方法。【方法】参考有关文献的方法提取获得水稻和小麦叶绿体,在离体条件下进行RSV-CP的叶绿体跨膜运输试验,同时研究孵育时间、病毒浓度等对RSV-CP在水稻叶绿体中离体跨膜运输的影响。【结果】在离体条件下5 min, RSV-CP即可进入RSV寄主植物水稻、小麦的叶绿体内,其离体跨膜运输的基本条件为RSV浓度58.1 μg/mL、孵育时间15 min。随着孵育时间的延长,进入叶绿体中的CP量有所增加;反应体系中RSV浓度加大,进入叶绿体中的RSV-CP量随之增加。【结论】离体条件下RSV-CP可进入寄主植物水稻、小麦的叶绿体中,病毒外壳蛋白进入叶绿体可能是其诱发花叶症状的主要原因之一。     

水稻条纹病毒外壳蛋白叶绿体离体跨膜运输研究

[目的]明确离体条件下水稻条纹病毒(RSV)外壳蛋白(CP)能否进入叶绿体,为研究RSV的致病机理提供依据和方法.[方法]参考有关文献的方法提取获得水稻和小麦叶绿体,在离体条件下进行RSV-CP的叶绿体跨膜运输试验,同时研究孵育时间、病毒浓度等对RSV-CP在水稻叶绿体中离体跨膜运输的影响.[结果]在离体条件下5min,RSV-CP即可进入RSV寄主植物水稻、小麦的叶绿体内,其离体跨膜运输的基本条件为RSV浓度58.1 μg/mL、孵育时间15 min.随着孵育时间的延长,进入叶绿体中的CP量有所增加;反应体系中RSV浓度加大,进入叶绿体中的RSV-CP量随之增加.[结论]离体条件下RSV-CP可进入寄主植物水稻、小麦的叶绿体中,病毒外壳蛋白进入叶绿体可能是其诱发花叶症状的主要原因之一.